Наш протокол позволяет исследователям анализировать процесс артериогенеза in vivo, отслеживая приверженность иммунных клеток и экстравазацию в растущих коллатеральных артериях в режиме реального времени. Метод многофотонной микроскопии позволяет визуализировать клеточную динамику в глубоких тканях живых моделей мышей с низкой фототоксичностью и с высоким пространственно-временным разрешением. Процедуру микроскопа продемонстрирует Доминик ван ден Хойвел, технический ассистент платформы многофотонной визуализации из лаборатории доктора Хелен Исикава-Анкерхольд.
Я продемонстрирую хирургическую процедуру. Для начала поместите анестезированную мышь в положение лежа на спине. Затем поместите два кусочка формованной глины под верхнюю заднюю конечность мыши, чтобы обеспечить ровное положение приводящей мышцы.
Поместите мышь под стереомикроскоп. После удаления волос с обеих ног продезинфицируйте и срежьте кожу по кругу вокруг рубца ранее перевязки бедренной артерии правой задней конечности. Удалите кожу и жировой слой с верхней части ноги и оттяните оставшуюся кожу с помощью швов, чтобы создать карман вокруг приводящей мышцы с коллатеральными сосудами.
Затем удалите подкожно-жировую клетчатку, чтобы получить четкое представление о приводящей мышце, артерии и вене profunda, а также о коллатеральных сосудах. Удалите поверхностный мышечный слой поверх коллатеральных сосудов с помощью тонких щипцов. Наполните подготовленный карман физиологическим раствором, чтобы предотвратить высыхание ткани, и продолжите ту же процедуру для фиктивно прооперированной левой задней конечности.
Перед визуализацией добавьте ультразвуковой гель в оба кармана, который предотвращает высыхание и служит погружной средой для оптического соединения с объективом. Включите ключ титаново-сапфирового лазерного бокса, блок электронных интерфейсов, нагревательный блок камеры инкубатора, люминесцентную лампу и компьютер. Запустите программное обеспечение для сбора данных.
Установите длину волны на 800 нанометров и откройте затвор микроскопа. В диалоговом окне мастера измерений выберите режим прибора как однолучевый, а режим измерения — как таймлапс 3D-сканирования. Затем перенесите анестезированную мышь в предварительно разогретую инкубационную камеру микроскопа и расположите область с ультразвуковым гелем непосредственно в контакте с передней линзой объектива.
Откройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа. Затем выберите подходящий фильтр или дихроичную настройку для визуализации FTSE. Определите интересующую область, проследив за кровотоком при эпифлуоресцентном освещении.
После того, как область интереса окажется в центре поля зрения, закройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа. В диалоговом окне сканера XY задайте необходимые параметры для размера изображения, пикселя, частоты, среднего значения строки. Отрегулируйте мощность лазера и установите усиление фотомножителя для зеленого, красного и синего каналов.
Выберите подходящий объектив для прижизненной визуализации и настройки коррекции дрейфа. Определите диапазон стека изображений, запустив режим предварительного просмотра, нажав красную кнопку в диалоговом окне мастера измерений. Чтобы получить хорошие изображения, определите интересующую область и структуру с помощью фокусировки.
Наблюдая за экраном, меняйте фокус, перемещая объектив до тех пор, пока изображение не исчезнет, и установите его равным нулю. Установите положение объектива в качестве последнего положения в осевом направлении. Затем измените фокус в противоположном направлении, перемещая объектив вниз, пока изображение снова не исчезнет с экрана.
Нажмите кнопку остановки в левом верхнем углу диалогового окна мастера измерений и установите размер шага равным двум микрометрам. Выберите ось python в качестве первого осевого устройства в диалоговом окне мастера измерений и выберите Не активировать режим автосохранения. Затем установите флажок автосохранения только на оси времени.
Затем нажмите значок Python в окне доступных устройств, чтобы открыть диалоговое окно Python. В настройках оси диалогового окна Python введите разделы «От» и «До», затем введите количество шагов. Перейдите в диалоговое окно XYZ stage Z и увеличьте диапазон сканирования на 200 микрометров с обоих концов.
Для этого введите 200 микрометров в начале и введите минус 240 микрометров в конце, и диапазон будет автоматически установлен как минус 440 микрометров. Откройте интерфейсный диалог VivoFollow. Начните получение изображения, нажав зеленую стрелку в верхнем левом углу диалогового окна мастера измерений.
Если используется коррекция дрейфа в реальном времени, найдите диалоговое окно для настройки коррекции дрейфа. Затем установите канал захвата, используемый как в мобильной ориентировке. Введите максимальное смещение поправки в микрометрах, добавленное к первой и последней позициям Z, и нажмите кнопку «ОК». Отслеживайте текущее смещение дрейфа в X, Y и Z в режиме реального времени во время получения изображения во внешнем диалоговом окне vivo flow и останавливайте получение изображений через 35 минут, когда требуется еще один цикл повторной инъекции анестезии.
Введите половину дозы смеси MMF и возобновите получение изображений до завершения эксперимента. Этот инструмент позволяет получать изображения в течение длительного времени, обеспечивает сбор высококачественных данных и подходит для отслеживания ячеек для измерения скорости. Как показано без коррекции дрейфа, интересующая область постепенно отдаляется от вида записи, влияя на возможность отслеживания ячеек для анализа скорости.
Тем не менее, стабильные видеоролики могут быть записаны с помощью программного обеспечения для коррекции дрейфа, и в течение длительного периода можно отслеживать больше ячеек. Программное обеспечение для коррекции дрейфа также может обеспечить визуализацию смещений X, Y и Z с течением времени, которые были скорректированы системой. Многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение для отслеживания лейкоцитов, при котором можно отслеживать и контролировать этапы и скорость миграции клеток.
Подготавливая коллатеральные сосуды к многофотонной визуализации, важно избежать повреждения коллатеральных артерий. Перед визуализацией важно безопасно определить правильную коллатеральную артерию. С помощью этой новой процедуры прижизненной многофотонной визуализации коллатеральных артерий можно анализировать адгезию и экстравазацию всех клеток крови in vivo путем изменения метки антитела.
