Предполагалось, что болезнь Паркинсона развивается и прогрессирует за счет прионоподобного размножения агрегатов альфа-синуклеина. В данном исследовании мы пытаемся связать происхождение патологии альфа-синуклеина в обонятельной луковице с болезнью Паркинсона. В последнее время считается, что патология альфа-синуклеина распространяется прионоподобным образом, начиная с обонятельной луковицы или дорсального ядра более крупного синапса.
Хотя происхождение агрегата альфа-синуклеина в обонятельной луковице остается неясным, недавние исследования показывают, что размножение может чередоваться со стороны обонятельной слизистой оболочки. Мы показали, что при другом введении агрегатов альфа-синуклеина на мышиной модели индуцировано патология альфа-синуклеина в обонятельной луковице. Этот простой метод обеспечивает еще один способ оценки распространения альфа-синуклеина от обонятельной слизистой оболочки к обонятельной луковице без хирургического вмешательства.
Интраназальное введение альфа-синуклеина является очень простым и понятным методом. Для начала наденьте средства индивидуальной защиты, такие как одноразовые перчатки, маски и защитные приспособления. Приготовьте раствор мышиной альфа-синуклеиновой клетчатки в PBS в концентрации четыре миллиграмм на миллилитр и оберните пробирку прозрачной пленкой для предотвращения загрязнения.
Затем наполните ультразвуковую ванну ультразвукового аппарата водой и добавьте кубики льда, чтобы охладить ее до четырех градусов Цельсия. Нанесите ультразвуком 200 микролитров раствора фибриллы, чтобы получить альфа-синуклеин предварительно сформированные фибриллы в течение пяти минут. Положите мышь под наркозом в лежачем положении на бумажное полотенце, слегка наклонив ее голову вниз.
Затем наберите один микролитр из четырех миллиграммов на миллилитр раствора альфа-синуклеина в пипетку P10 и поместите кончик пипетки рядом с носом мыши, чтобы на конце кончика пипетки образовалась круглая капля. Теперь интраназально вводите раствор в одностороннюю ноздрю. Подождите от 30 секунд до одной минуты, чтобы мышь естественным образом вдохнула раствор.
Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет введено 20 микролитров альфа-синуклеина. После введения альфа-синуклеина очистите стол коммерческими моющими средствами, если произошло какое-либо загрязнение раствором, и выбросьте перчатки, затем введите атипамезол в дозе три миллиграмма на килограмм путем внутрибрюшинной инъекции для облегчения восстановления. После полного восстановления верните мышь в клетку.
Для начала введите альфа-синуклеин преформированные фибриллы мышам интраназально. Усыпив мышь, сделайте скальпелем двухсантиметровый надрез на коже головы. С помощью ножниц надрежьте черепную кость латерально от основания к носу.
Чтобы получить обонятельные луковицы, полностью удалите черепную кость, покрывающую обонятельные луковицы, затем переверните голову и перережьте нервы мозга. Аккуратно удалите мозг с помощью щипцов, сохранив обонятельные луковицы в целости. Чтобы сохранить луковицы, осторожно разрежьте обонятельные нервы, когда они прикрепляются к кости черепа.
Поместите образцы мозга в 4%-ный параформный альдегид, приготовленный в PBS, и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Патология альфа-синуклеина не наблюдалась в обонятельной луковице на обработанной стороне через 1 раз в 3 месяца, но агрегаты нейрит-подобных P альфа-синуклеина Леви наблюдались в клубочках на стороне лечения через 6 и 12 месяцев. Эти агрегаты отсутствовали в лампочках на контрольной стороне.
Количество агрегатов нейритоподобных альфа-синуклеинов Леви достоверно увеличивалось в обонятельных луковицах на обработанной стороне в течение 12 месяцев, в то время как на контрольной стороне таких агрегатов было очень мало.
