Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга и приводит к потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глией и писсуарными клетками оказывает давление после ишемического события. Для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глии в ишемической среде.
Здесь мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной коры крыс, и что с помощью конкретных культурных сред позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нео-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью. Для изучения перекрестного стебля между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в крышках скользит поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрыных в многофункциональных пластин. Эти две культуры поддерживаются частью небольших парафиновых сфер.
Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретного лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях. Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.
Начните с изоляции эмбриональной коры крысы. Эмбрионы были получены из семьи крыс в 15 дней беременности и помещаются в стерильную трубку Falcon, содержащую PBS. Все еще внутри эмбрионов пакетика желтка помещены внутри чашки Петри, содержащей холодный PBS.
С помощью ножниц и пинцета желточный мешок нарушается, и эмбрион удаляется и помещается в другую чашку Петри, содержащую холодный PBS над пакетом со льдом. Необходимо быть очень осторожным при нарушении желточный мешок, чтобы не повредить эмбрион. Распоить эмбрион под рассечением микроскопа, аккуратно зафиксировать эмбрион с помощью twizzer.
Первоначальный разрез должен быть параллельным коре головного мозга. Будьте осторожны, чтобы не обезглавить животное. Кожу головы и тщательно удаляют, чтобы не повредить ткани коркового мозга.
Следующий разрез отделяет кору. Удалите кровеносные сосуды, присутствующие в ткани. Наконец, используя пипетку, перенесите корковую ткань в трубку Falcon с помощью PBS.
Одноклеточная суспензия получена путем механического пищеварения ткани головного мозга с помощью кончиков с уменьшением диаметра. Убедитесь, что ткань хорошо гомогенизирована После пищеварения, центрифуга материала на 400 Gs в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и ассизентьте осадок в среде культуры, предварительно разогретой до 37 градусов.
Рассчитайте общее количество ячеек, присутствующих в подвеске с помощью камеры Neubauer и препарировать разбавление для адекватной плотности клеток. Наконец, семена клеток в мульти-хорошо и инкубировать при 37 градусов. Для того, чтобы подготовить материал для системы совместной культуры, нагреть парафин в нагревательном блоке, пока он не станет жидким.
Затем с помощью стереостекла Пастер пипетка подготовить небольшие сферы над крышкой скользит, которые ранее были помещены в несколько хорошо, и покрыты Поли-D-Лизин. За 24 часа до того, как две культуры совесят, измените культурную среду нейронов и астроцитов, чтобы дополнить ее NBM тепловой инактивированной FBS или без нее. Когда две культуры будут готовы к использованию, перенесите нейрон, сидящий в крышке, скользит парафиновые сферы в скважины, содержащие астроциты с помощью пинцета, ранее погруженного в 70% этанола.
После размещения обоих типов клеток в контакте, ждать от восьми до 12 часов, а затем начать различные стимулы и процедуры. Лишение кислорода и глюкозы осуществляется в культуре с семи дней роста. Удалить культуру среды, и мыть клетки два раза с HBSS среды без добавок глюкозы.
Убедитесь, что вся среда, содержащая глюкозу, промывается. Печать Гипоксия камеры и добавить газовую смесь, содержащую 95% азота и 5%углекислого газа в течение четырех минут с потоком 20 литров в течение нескольких минут, с тем чтобы заменить кислород присутствует внутри камеры. Затем остановите поток и поместите камеру Гипоксии в инкубатор при 37 градусах.
После периода лишения кислорода и глюкозы, заменить средний, HBSS без добавок глюкозы с соответствующей среде культуры для остальных процедур и инкубировать клетки на 37 градусов. Для того, чтобы охарактеризовать тип корковой культуры, мы выполнили иммуногистохимию в трех типах корковых культур для оценки количества клеток, которые выразили GFPA или MAP2, которые являются маркерами широко используются для астроцитных и нейрональных клеток соответственно. Этот анализ показал, что, когда этот протокол, мы смогли получить чистую обогащенную культуру астроцитов с около 97% клеток, выражаюющих GFAP.
Что касается обогащенной нейронами культуры, мы проверили около 78% клеток, выражаюющих MAP2. Однако мы выявляем около 18% отрицательных ячеек GFAP и MAP2. Для нейронно-глиальной корковой культуры, Было отмечено, что около 49% клеток MAP2 положительные.
31% являются GFAP положительными. И 20% они не несут ответственности за GFAP или MAP2. Через семь дней после создания корковой культуры культура нейронов и обогащенная нейронами культура подвергались процедуре OGD в течение 4 и 6 часов.
После этой процедуры клетки были помечены MAP2, а затем количество положительных клеток MAP2 было количественно с помощью микроскопии флуоресценции. В нейронно-глиальной культуре наблюдалось снижение примерно на 30% числа нейронов, когда культура была представлена в период OGD 4 часа. После периода OGD 6 часов, расширение поражения увеличивается, достигнув около 60% от потери нейронов.
Что касается обогащенной культуры нейронов, подвергшихся воздействию OGD, было отмечено около 41% и 64% снижение числа клеток MAP2. Кроме того, было отмечено, что в обогащенной нейронами культуре, было небольшое увеличение увеличения травмы по сравнению с нейронно-глиальной культуры также подвергаются ОГД в течение 4 часов. В заключение, здесь представляют собой модель in vitro для изучения ишемического инсульта, установленного простым, быстрым, дорогим и воспроизводимым способом.
Кроме того, описанный метод также позволяет реализовать нейроны и обогащенные астроцитами первичные культуры, а также культуру нейронов-глий. Таким образом, обеспечивая большую модель in-vitro для моделирования нескольких заболеваний мозга с более высоким уровнем сложности, чем увековеченные клеточные линии и чистые нейронные или глиальные культуры.
