허혈성 뇌졸중은 뇌 조직의 저혈당을 특징으로하는 임상 상태이며 신경 손실의 결과입니다. 수많은 증거는 심교와 소변 세포 사이 상호 작용이 허혈성 사건 후에 압력 효력을 발휘한다는 것을 건의합니다. 잠재적인 보호 메커니즘을 탐구 하기 위해, 허 혈 환경에서 신경-glia 상호 작용을 공부 하는 데 허용 하는 모델을 개발 하는 것이 중요 하다.
여기서 우리는 쥐 배아 피질에서 성상 세포와 뉴런을 분리하는 간단한 접근 법을 제시하고, 특정 문화 매체를 사용하여 높은 수율과 재현성을 가진 뉴런 또는 성상세포 농축 문화 또는 신아교 문화의 설립을 허용한다는 것을. 성상 세포와 뉴런 사이의 교차 토크를 연구하기 위해, 우리는 커버 전표에서 배양 된 뉴런이 다중 우물 판에 도금 된 성상 세포의 단층과 접촉하여 유지되는 공동 배양 시스템을 기반으로 하는 접근법을 제안합니다. 두 문화권은 작은 파라핀 구체에 의해 일부를 유지한다.
이 접근은 독립적인 조작 및 많은 연구 결과에서 이점을 나타내는 각 세포 모형에 특정 처리의 적용을 허용합니다. 허혈성 뇌졸중 중에 발생하는 것을 시뮬레이션하기 위해 배양은 산소 및 포도당 박탈 프로토콜을 받습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중에서 신경 신경 교상호작용의 역할을 연구하는 유용한 도구를 나타냅니다.
쥐 배아 피질 절연으로 시작합니다. 배아는 임신 15일에서 쥐 의 가족으로부터 얻어졌고 PBS를 포함하는 멸균 팔콘 튜브에 배치됩니다. 여전히 노른자 봉지 배아 안에 차가운 PBS가 들어있는 페트리 접시 안에 배치됩니다.
가위와 핀셋의 도움으로 노른자 주머니가 부러지고 배아가 제거되어 얼음 팩 위에 차가운 PBS가 들어있는 다른 페트리 접시에 넣습니다. 노른자 주머니를 부러뜨려 배아를 손상시키지 않을 때는 매우 조심해야 합니다. 해부 현미경 의 밑에 태아를 놓고, 트위저로 태아를 부드럽게 고정합니다.
초기 절개는 피질과 평행해야 합니다. 동물을 참수하지 않도록주의하십시오. 두피는 피질 뇌 조직을 손상시키지 않도록 조심스럽게 제거됩니다.
이 다음 절개는 피질을 분리합니다. 조직에 존재하는 혈관을 제거합니다. 마지막으로, 파이펫을 사용하여 피질 조직을 PBS가 있는 팔콘 튜브로 옮기십시오.
단일 세포 현탁액은 직경이 감소하는 팁을 사용하여 피질 뇌 조직의 기계적 소화를 통해 얻을 수 있습니다. 소화 후 조직이 균질화되었는지 확인하고 물질을 400 Gs에서 3 분 동안 원심 분리하십시오. 상체를 버리고 이전에 37도까지 따뜻하게 한 문화 매체의 퇴적물을 다시 중단합니다.
노이바우어 챔버를 사용하여 현탁액에 존재하는 총 세포 수를 계산하고 적절한 세포 밀도에 대한 희석을 준비한다. 마지막으로, 멀티 웰에서 세포를 씨앗과 37도에서 배양. 공동 배양 시스템에 대한 재료를 준비하기 위해, 액체가 될 때까지 가열 블록에 파라핀을 가열.
그런 다음 스테레오 유리 파스퇴르 파이펫의 도움으로 이전에 멀티 웰에 배치된 커버 슬립 위에 작은 구체를 준비하고 폴리 D-Lysine로 코팅합니다. 24 시간 전에 두 배양접촉, 열 불활성화 FBS 의 유무에 관계없이 NBM을 보충하기 위해 뉴런과 성상 세포의 배양 매체를 변경합니다. 두 배양체가 사용할 준비가 되면 파라핀 구체가 있는 커버 슬립에 앉아 있는 뉴런을 70%에 탄올에 침수한 핀셋을 사용하여 성상세포를 함유한 우물로 옮겨 넣습니다.
두 세포 유형을 접촉한 후 8~12시간을 기다린 다음 다른 자극및 절차를 시작합니다. 산소와 포도당 박탈은 7일간의 성장과 함께 배양에서 수행됩니다. 배양 배지를 제거하고 포도당 보충 없이 HBSS 배지로 세포를 두 번 세척한다.
포도당을 포함하는 모든 매체가 세척되어 있는지 확인하십시오. 저산소챔버를 밀봉하고 챔버 내부에 존재하는 산소를 대체하기 위해 분 동안 20 리터의 흐름으로 4 분 동안 95 %의 질소와 5 %의 이산화탄소를 포함하는 가스 믹스를 추가하십시오. 그런 다음 흐름을 멈추고 저산소챔버를 인큐베이터에 37도 배치합니다.
산소 및 포도당 박탈 기간 후, 배지를 대체, 나머지 절차에 대한 적절한 배양 배지로 포도당 보충없이 HBSS를 교체하고 37도에서 세포를 배양. 피질 배양의 유형을 특성화하기 위해, 우리는 각각 성상 세포및 신경 세포에 널리 사용되는 마커인 GFPA 또는 MAP2를 발현한 세포의 수를 평가하기 위해 피질 배양의 3가지 유형에서 면역조직화학을 수행하였다. 이러한 분석은 이 프로토콜이 면결될 때, 우리는 GFAP를 표현하는 세포의 대략 97%와 함께 성상세포의 순수한 농축된 배양을 얻을 수 있었다는 것을 밝혔습니다.
신경이 풍부한 배양에 관해서는, 우리는 MAP2를 표현하는 세포의 대략 78%를 확인했습니다. 그러나 우리는 GFAP와 MAP2 음성 세포의 대략 18%를 확인합니다. 뉴런-신경교 피질 배양에 대해서는 세포의 약 49%가 MAP2 양성인 것으로 관찰되었다.
31%는 GFAP 양성입니다. 그리고 20%는 GFAP나 MAP2에 대해 책임을 지지 않습니다. 피질 배양 후 7일 후, 뉴런-글리아 배양과 뉴런농축 배양은 4시간 6시간 동안 OGD 절차를 거쳤다.
이 절차 후, 세포는 MAP2로 표지되었고, 이어서 MAP2 양성 세포의 수는 형광 현미경 검사를 사용하여 정량화되었다. 뉴런-글리아 배양에서, 배양이 OGD 기간에 제출되었을 때 뉴런의 수에서 약 30%의 감소를 관찰하였다. 6 시간의 OGD 기간 후에, 병변의 연장은 뉴런 손실의 대략 60%에 도달합니다 증가합니다.
OGD에 노출된 뉴런의 농축 배양에 대해서는 MAP2 세포의 수가 약 41% 및 64% 감소하는 것으로 관찰되었다. 더욱이, 뉴런 농축 배양에서는 4시간 동안 OGD에 노출된 뉴런-글리아 배양과 비교했을 때 부상 연장이 약간 증가하는 것으로 관찰되었다. 결론적으로, 여기에 간단하고 빠르며 비싸고 재현 가능한 방식으로 확립 된 허혈성 뇌졸중을 연구하는 시험관 내 모델을 나타냅니다.
또한, 설명 된 방법은 또한 뉴런과 성상 세포농축 1 차 문화를 구현 할 수 있습니다, 뿐만 아니라 뉴런 - glia 문화. 따라서, 불멸의 세포주 및 순수한 신경 또는 신경교 배양보다는 복잡성의 더 높은 수준으로 몇몇 두뇌 질병을 모델링을 위한 훌륭한 시험관 내 모형을 제공합니다.
