İskemik inme beyin dokusunun hipoperfüzyonu ile karakterize klinik bir durumdur ve nöronal kayıp ile sonuçlanır. Çok sayıda kanıt glia ve pisuar hücreleri arasındaki etkileşim bir iskemik olaydan sonra basınç etkileri uygulamak öneririz. Potansiyel koruyucu mekanizmaları araştırmak için, iskemik bir ortamda nöron-glia etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlayan modeller geliştirmek önemlidir.
Burada rat embriyonik korteksten astrositleri ve nöronları izole etmek için basit bir yaklaşım saklıyız ve özel kültürel ortam kullanarak nöron veya astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile neo-glia kültürlerin kurulmasına olanak sağlar. Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için, kapak fişleri içinde kültürlenen nöronların çok kuyulu plakalarla kaplanmış bir monokat astrositle temas halinde tutuldukları ortak kültür sistemine dayalı bir yaklaşım öneriyoruz. İki kültür küçük parafin küreler tarafından bir parçası korunur.
Bu yaklaşım bağımsız manipülasyon ve birçok çalışmada bir avantaj temsil eden her hücre tipi, özel tedavi uygulanması sağlar. Iskemik inme sırasında meydana gelen leri simüle etmek için, kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolüne tabi tutulur. Bu protokol iskemik inme nöron-glia etkileşimlerinin rolünü incelemek için yararlı bir araç temsil eder.
Fare embriyonik korteks yalıtımı ile başlayın. Embriyolar 15 günlük gebelikte fare ailesinden elde edildi ve PBS içeren steril bir Falcon tüpüne yerleştirildi. Hala sarısı poşet embriyolar soğuk PBS içeren bir petri kabıiçine yerleştirilir.
Makas ve cımbız yardımıyla, sarısı kese kırık ve embriyo kaldırılır ve bir buz paketi üzerinde soğuk PBS içeren başka bir petri kabına yerleştirilir. Embriyoya zarar vermemek için yumurta kesesini kırarken çok dikkatli olmak gerekir. Embriyoyu bir kesişme mikroskobu altında yerleştirin, bir twizzer kullanarak embriyoyu nazikçe düzeltin.
İlk kesi kortekse paralel olmalı. Hayvanın kafasını kesmemeye dikkat et. Kafa derisi ve dikkatle kortikal beyin dokusuzarar değil kaldırılır.
Sıradaki kesik korteksi ayırıyor. Dokuda bulunan kan damarlarını çıkarın. Son olarak, bir pipet kullanarak, PBS ile bir Falcon tüp kortikal doku aktarın.
Tek hücreli süspansiyon azalan çapı ile ipuçları kullanılarak kortikal beyin dokusunun mekanik sindirim yoluyla elde edilir. Doku iyi homojenize olduğundan emin olun sindirim sonra, üç dakika boyunca 400 Gs malzeme santrifüj. Supernatant atın ve kültür orta tortu askıya, daha önce 37 dereceye ısıtılır.
Neubauer haznesini kullanarak süspansiyonda bulunan toplam hücre sayısını hesaplayın ve yeterli hücre yoğunluğu için seyreltme yi önceden hesaplayın. Son olarak, 37 derece de çok kuyuve kuluçka hücreleri tohum. Malzemeyi ortak kültür sistemine hazırlamak için parafini sıvı hale gelene kadar ısıtma bloğunda ısıtın.
Daha sonra, bir stereo cam Pasteur pipet yardımıyla daha önce çok kuyuya yerleştirilen ve Poly-D-Lysine ile kaplanmış kapak fişleri üzerinde küçük küreler hazırlayın. 24 saat önce iki kültür temas getirilir, nöronların kültür ortamı değiştirmek ve ısı inaktive FBS olmadan NBM tamamlamak için. İki kültür kullanıma hazır olduğunda, parafin küreleri ile kapak fişleri oturan nöron transferi daha önce% 70 etanol batırılmış bir cımbız kullanarak astrosit içeren kuyulara.
Her iki hücre türünü de temas halinde yerleştirdikten sonra, sekiz ila 12 saat bekleyin ve sonra farklı uyaranları ve yordamları başlatın. Oksijen ve glikoz yoksunluğu büyüme yedi gün ile bir kültürde gerçekleştirilir. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri glikoz takviyesi olmadan HBSS ortamı ile iki kez yıkayın.
Glikoz içeren tüm ortamın yıkandığından emin olun. Hipoksi Odası'nı kapatın ve odanın içindeki oksijeni değiştirmek için 20 litrelik bir akışla dört dakika boyunca %95 azot ve %5 karbondioksit içeren gaz karışımını ekleyin. Sonra, akışı durdurun ve Hipoksi Odası'nı 37 derecede bir kuvöze yerleştirin.
Oksijen ve glikoz yoksunluğu döneminden sonra, kalan işlemler için uygun kültür ortamı ile glikoz takviyesi olmadan orta, HBSS değiştirin ve 37 derece hücreleri kuluçka. Kortikal kültürün türünü karakterize etmek için, sırasıyla astrositik ve nöronal hücreler için yaygın olarak kullanılan belirteçler olan GFPA veya MAP2'yi ifade eden hücre sayısını değerlendirmek için kortikal kültürlerin üç türünde immünohistokimya uyguladık. Bu analizler, bu protokol de, gfap ifade hücrelerinin yaklaşık% 97 ile astrositsaf zenginleştirilmiş bir kültür elde başardık ortaya koymuştur.
Nöron la zenginleştirilmiş kültür ile ilgili olarak, MAP2 ifade hücrelerinin yaklaşık% 78 doğruladı. Ancak GFAP ve MAP2 negatif hücrelerinin yaklaşık %18'ini tanımlarız. Nöron-glia kortikal kültür için, Bu hücrelerin yaklaşık% 49 MAP2 pozitif olduğu gözlenmiştir.
%31'i GFAP pozitiftir. Ve %20'si GFAP'den ya da MAP2'den sorumlu değiller. Kortikal kültür kuruluşundan yedi gün sonra, nöron-glia kültürü ve nöron la zenginleştirilmiş kültür 4 ve 6 saat boyunca OGD prosedürüne tabi tutuldu.
Bu işlemden sonra hücreler MAP2 ile etiketlendi ve daha sonra MAP2 pozitif hücrelerin sayısı floresan mikroskopi kullanılarak ölçüldü. Nöron-glia kültüründe, kültürün 4 saatlik bir OGD dönemine sunulduğunda nöronların sayısında yaklaşık %30'luk bir azalma gözlendi. 6 saatlik bir OGD döneminden sonra lezyonun uzaması artar ve nöronal kaybın yaklaşık %60'ına ulaşır.
OGD'ye maruz kalan nöronların zenginleştirilmiş kültürü ile ilgili olarak MAP2 hücrelerinin sayısında yaklaşık %41 ve %64 azalma gözlendi. Ayrıca, nöron zenginleştirilmiş kültürde, 4 saat boyunca OGD'ye maruz kalan nöron-glia kültürüne kıyasla yaralanma uzantısında hafif bir artış olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak, burada basit, hızlı ve pahalı ve tekrarlanabilir bir şekilde kurulan iskemik inme çalışması için bir in vitro modeli temsil etmektedir.
Ayrıca, açıklanan yöntem aynı zamanda nöronlar ve astrosit zenginleştirilmiş birincil kültürlerin uygulanmasına olanak sağlar, aynı zamanda bir nöron-glia kültürü. Böylece, karmaşıklık daha yüksek bir düzeyde çeşitli beyin hastalıkları modelleme için büyük bir in-vitro model sağlayan, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve saf nöronal veya glial kültürlerdaha.
