Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion von Hirngewebe gekennzeichnet ist und zu neuronaischem Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen Glia- und Urinalzellen die Druckeffekte nach einem ischämischen Ereignis ausübt. Um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen, ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die das Studium neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung ermöglichen.
Hier stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und dass durch die Verwendung eines spezifischen kulturellen Mediums die Etablierung von neuronen- oder astrozytenangereicherten Kulturen oder Neogliakulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglicht. Um das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, bei dem Neuronen, die in Deckschscheinen kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multi-Well-Platten plattiert sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln ein Teil erhalten.
Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation und die Anwendung einer spezifischen Behandlung auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt. Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.
Beginnen Sie mit der embryonalen Kortex-Isolierung der Ratte. Die Embryonen wurden bei 15 Tagen Trächtigkeit aus einer Rattenfamilie gewonnen und in eine sterile Falcon-Röhre mit PBS-Haltigem gebracht. Noch im Inneren des Dotterbeutels werden Embryonen in eine Petrischale mit kaltem PBS gelegt.
Mit Hilfe von Schere und Pinzette wird der Eigelbsack gebrochen, und der Embryo wird entfernt und in eine andere Petrischale mit kaltem PBS über einer Eispackung gelegt. Es ist notwendig, sehr vorsichtig zu sein, wenn Sie den Dottersack brechen, um den Embryo nicht zu beschädigen. Positionieren Sie den Embryo unter einem Sezierendes Mikroskop, fixieren Sie den Embryo vorsichtig mit einem Twizzer.
Der anfängliche Schnitt sollte parallel zum Kortex erfolgen. Achten Sie darauf, das Tier nicht zu enthaupten. Die Kopfhaut und werden sorgfältig entfernt, um das kortikale Hirngewebe nicht zu beschädigen.
Dieser nächste Schnitt trennt den Kortex. Entfernen Sie die im Gewebe vorhandenen Blutgefäße. Schließlich, mit einer Pipette, übertragen Sie das kortikale Gewebe auf ein Falcon-Rohr mit PBS.
Die einzellige Suspension wird durch mechanische Verdauung des kortikalen Hirngewebes mit Spitzen mit abnehmendem Durchmesser erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe gut homogenisiert ist Nach der Verdauung zentrieren Sie das Material bei 400 Gs für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Sediment im Kulturmedium wieder auf, das zuvor auf 37 Grad erwärmt wurde.
Berechnen Sie die Gesamtzahl der in der Suspension vorhandenen Zellen mit einer Neubauer-Kammer und präganieren Sie die Verdünnung für die angemessene Zelldichte. Schließlich säen Sie die Zellen im Multi-Well und brüten bei 37 Grad. Um das Material für das Co-Kultursystem vorzubereiten, erhitzen Sie das Paraffin in einem Heizblock, bis es flüssig wird.
Dann bereiten Sie mit Hilfe einer Stereoglas Pasteur Pipette kleine Kugeln über die Abdeckung Supscheine, die zuvor in einem Multi-Well platziert und mit Poly-D-Lysin beschichtet wurden. 24 Stunden bevor die beiden Kulturen in Kontakt gebracht werden, ändern Sie das Kulturmedium von Neuronen und Astrozyten, um es NBM mit oder ohne Hitze inaktiviert FBS zu ergänzen. Wenn die beiden Kulturen einsatzbereit sind, übertragen Sie das Neuron, das in der Abdeckung sitzt, mit Paraffinkugeln auf Brunnen, die Astrozyten enthalten, mit einer Pinzette, die zuvor in 70% Ethanol eingetaucht war.
Nachdem Sie beide Zelltypen in Kontakt gebracht haben, warten Sie acht bis zwölf Stunden, und starten Sie dann die verschiedenen Reize und Verfahren. Der Sauerstoff- und Glukosemangel wird in einer Kultur mit sieben Tagen Wachstum durchgeführt. Entfernen Sie das Kulturmedium, und waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS Medium ohne Glukose-Supplementierung.
Achten Sie darauf, dass das gesamte Mittel, das Glukose enthält, gewaschen wird. Versiegeln Sie die Hypoxie-Kammer und fügen Sie die Gasmischung mit 95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid für vier Minuten mit einem Durchfluss von 20 Litern für Minuten hinzu, um den sauerstoffhaltigen Sauerstoff in der Kammer zu ersetzen. Dann stoppen Sie den Fluss und legen Sie die Hypoxie-Kammer in einem Inkubator bei 37 Grad.
Nach der Zeit der Sauerstoff- und Glukoseentzug, ersetzen Sie das Medium, HBSS ohne Glukose-Supplementierung mit dem entsprechenden Kulturmedium für die verbleibenden Verfahren und inkubieren die Zellen bei 37 Grad. Um die Art der kortikalen Kultur zu charakterisieren, führten wir Eine Immunhistochemie in den drei Arten von kortikalen Kulturen durch, um die Anzahl der Zellen zu bewerten, die GFPA oder MAP2 exprimierten, die Marker sind, die für astrozytische bzw. neuronale Zellen weit verbreitet sind. Diese Analyse ergab, dass wir, als dieses Protokoll, in der Lage waren, eine reine angereicherte Kultur von Astrozyten zu erhalten, mit etwa 97% der Zellen, die GFAP exdrücken.
In Bezug auf die neuron-angereicherte Kultur haben wir etwa 78% der Zellen überprüft, die MAP2 exdrücken. Wir identifizieren jedoch etwa 18% der GFAP- und MAP2-Negativzellen. Für die neuron-glia kortikale Kultur, Es wurde beobachtet, dass etwa 49% der Zellen MAP2 positiv sind.
31% sind GFAP-positiv. Und 20% sie sind nicht haftbar für GFAP oder MAP2. Sieben Tage nach dem kortikalen Kultur-Establishment wurden die Neuron-Glia-Kultur und die neuron-angereicherte Kultur 4 und 6 Stunden lang einem OGD-Verfahren unterzogen.
Nach diesem Verfahren wurden die Zellen mit MAP2 beschriftet und dann die Anzahl der MAP2-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. In der Neuron-Glia-Kultur wurde ein Rückgang der Anzahl der Neuronen um etwa 30% beobachtet, als die Kultur einer OGD-Periode von 4 Stunden unterzogen wurde. Nach einer OGD-Periode von 6 Stunden nimmt die Verlängerung der Läsion zu und erreicht etwa 60% des neuronalen Verlustes.
In Bezug auf die angereicherte Kultur der Neuronen, die OGD ausgesetzt sind, wurde eine Abnahme der Anzahl der MAP2-Zellen um 41 % und 64 % beobachtet. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in der neuron-angereicherten Kultur, gab es eine leichte Zunahme der Verletzungsverlängerung im Vergleich zu den Neuron-Glia-Kultur auch OGD während 4 Stunden ausgesetzt. Zusammenfassend stellt hier ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls dar, das auf einfache, schnelle und teure und reproduzierbare Weise etabliert wurde.
Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Methode auch die Implementierung von Neuronen und astrozytenangereicherten Primärkulturen, aber auch eine neuron-glia Kultur. So bietet ein großartiges In-vitro-Modell für die Modellierung mehrerer Gehirnerkrankungen mit einem höheren Maß an Komplexität, als verewigte Zelllinien und reine neuronale oder gliaale Kulturen.
