O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral e resulta em perda neuronal. Numerosas evidências sugerem que a interação entre glia e células urinárias exercem os efeitos de pressão após um evento isquêmico. Para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico.
Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que usando meio cultural específico permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neo-glia com alto rendimento e reprodutibilidade. Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem, baseada em um sistema de cocultura, no qual neurônios cultivados em deslizamentos de cobertura são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multi-poços. As duas culturas são mantidas como parte por pequenas esferas de parafina.
Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamento específico a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos. Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.
Comece com o isolamento do córtex embrionário de rato. Os embriões foram obtidos de uma família de ratos com 15 dias de gestação e são colocados em um tubo Falcão estéril contendo PBS. Ainda dentro da gema os embriões de sachê são colocados dentro de uma placa de petri contendo PBS frio.
Com a ajuda de tesouras e pinças, o saco de gema é quebrado, e o embrião é removido e colocado em outra placa de petri contendo PBS frio sobre uma bolsa de gelo. É necessário ter muito cuidado ao quebrar o saco de gema para não danificar o embrião. Posicione o embrião sob um microscópio dissecando, conserte suavemente o embrião usando um twizzer.
A incisão inicial deve ser paralela ao córtex. Cuidado para não decapitar o animal. O couro cabeludo e são cuidadosamente removidos para não danificar o tecido cerebral cortical.
Esta próxima incisão separa o córtex. Remova os vasos sanguíneos presentes no tecido. Finalmente, usando uma pipeta, transfira o tecido cortical para um tubo Falcon com PBS.
A suspensão de célula única é obtida através da digestão mecânica do tecido cerebral cortical usando pontas com diâmetro decrescente. Certifique-se de que o tecido está bem homogeneizado Após a digestão, centrifufique o material a 400 Gs por três minutos. Descarte o supernasce, e resuspenque o sedimento em meio de cultura, previamente aquecido a 37 graus.
Calcule o número total de células presentes na suspensão usando uma câmara de Neubauer e prepare a diluição para a densidade celular adequada. Finalmente, semear as células no multi-poço e incubar a 37 graus. Para preparar o material para o sistema de cocultura, aqueça a parafina em um bloco de aquecimento até que se torne líquida.
Em seguida, com a ajuda de um vidro estéreo, a pipeta Pasteur prepara pequenas esferas sobre os deslizamentos de cobertura que foram previamente colocados em um multi-poço, e revestidos com Poli-D-Lysine. 24 horas antes das duas culturas serem trazidas em contato, mude o meio cultural dos neurônios e astrócitos para suplementá-lo NBM com ou sem FBS inativados por calor. Quando as duas culturas estiverem prontas para uso, transfira o neurônio, sentado na tampa desliza com esferas de parafina para poços contendo astrócitos usando uma pinça anteriormente imersa em 70% de etanol.
Depois de colocar ambos os tipos de células em contato, espere de oito a 12 horas e, em seguida, inicie os diferentes estímulos e procedimentos. A privação de oxigênio e glicose é realizada em uma cultura com sete dias de crescimento. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com o meio HBSS sem suplementação de glicose.
Certifique-se de que todo o meio que contém glicose está lavado. Sele a Câmara de Hipóxia e adicione a mistura de gás contendo 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono por quatro minutos com um fluxo de 20 litros por minutos, a fim de substituir o oxigênio presente dentro da câmara. Em seguida, pare o fluxo e coloque a Câmara de Hipóxia em uma incubadora a 37 graus.
Após o período de privação de oxigênio e glicose, substitua o médio, HBSS sem suplementação de glicose pelo meio de cultura adequado para os procedimentos restantes e incubar as células a 37 graus. Para caracterizar o tipo de cultura cortical, realizamos a imunohistoquímica nos três tipos de culturas corticais para avaliar o número de células que expressavam GFPA ou MAP2, que são marcadores amplamente utilizados para células astrocíticas e neuronais, respectivamente. Essas análises revelaram que, quando este protocolo, conseguimos obter uma cultura pura e enriquecida de astrócitos com cerca de 97% das células expressando GFAP.
Em relação à cultura enriquecida com neurônios, verificamos cerca de 78% das células expressas MAP2. No entanto, identificamos cerca de 18% das células negativas GFAP e MAP2. Para a cultura cortical neurônio-glia, observou-se que cerca de 49% das células são MAP2 positivas.
31% são GFAP positivos. E 20% não são responsáveis por GFAP nem MAP2. Sete dias após o estabelecimento da cultura cortical, a cultura neurônio-glia e a cultura enriquecida com neurônios foram submetidas a um procedimento OGD por 4 e 6 horas.
Após esse procedimento, as células foram rotuladas com MAP2 e, em seguida, o número de células positivas MAP2 foram quantificadas por meio de microscopia de fluorescência. Na cultura neuron-glia, observou-se uma diminuição de cerca de 30% no número de neurônios, quando a cultura foi submetida a um período de OGD de 4 horas. Após um período de OGD de 6 horas, a extensão da lesão aumenta, atingindo cerca de 60% da perda neuronal.
Quanto à cultura enriquecida dos neurônios expostos ao OGD, observou-se uma redução de cerca de 41% e 64% no número de células MAP2. Além disso, observou-se que na cultura enriquecida com neurônios, houve um ligeiro aumento na extensão da lesão quando comparada à cultura neurônio-glia também exposta ao OGD durante 4 horas. Em conclusão, aqui representam um modelo in vitro para estudar o avc isquêmico estabelecido de forma simples, rápida e cara e reprodutível.
Além disso, o método descrito também permite implementar neurônios e culturas primárias enriquecidas por astrócitos, mas também uma cultura neurônio-glia. Assim, fornecendo um ótimo modelo in vitro para modelar várias doenças cerebrais com um nível mais elevado de complexidade, do que linhas celulares imortalizadas e culturas neuronais ou gliais puras.
