虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流を特徴とする臨床状態であり、神経細胞の喪失をもたらす。多くの証拠は、グリアと小便器細胞の相互作用が虚血性イベント後に圧力効果を発揮することを示唆している。潜在的な保護メカニズムを探求するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。
ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトとニューロンを分離するための簡単なアプローチを提示し、特定の文化的媒体を使用することで、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物または高収率および再現性を持つネオグリア培養物の確立を可能にする。アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバースリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球体によって一部維持される。
このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプに特定の治療の適用を可能にし、多くの研究において利点を表す。虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。
ラット胚性皮質絶縁体から始めます。胚は、妊娠15日でラットの家族から得られ、PBSを含む無菌ファルコンチューブに入れられた。まだ卵黄袋の胚の中には、冷たいPBSを含むシャーレの中に置かれています。
はさみとピンセットの助けを借りて、黄身嚢が壊れ、胚が取り除かれ、氷パックの上に冷たいPBSを含む別のシャーレに入れられます。卵黄嚢を壊すときに胚を損傷しないように注意する必要があります。胚を解剖顕微鏡の下に置き、ツイザーを使用して胚を穏やかに固定する。
最初の切開は皮質と平行であるべきである。動物の首を切り落とさないように注意してください。頭皮と皮質脳組織を損傷しないように慎重に除去されます。
この次の切開は皮質を分離する。組織に存在する血管を取り除く。最後に、ピペットを使用して、皮質組織をPBSでファルコンチューブに移す。
単一細胞懸濁液は、直径を減少させる先端を用いて皮質脳組織の機械的消化を通じて得られる。消化後、400 Gsで材料を3分間遠心分離して、組織が均質化されていることを確認してください。上清を捨て、培地中の堆積物を再懸濁し、以前に37度まで温めた。
Neubauerチャンバーを使用して懸濁液中に存在する細胞の総数を計算し、適切な細胞密度のために希釈を準備する。最後に、マルチウェルに細胞を播種し、37度でインキュベートします。共培養システム用の材料を調製するために、パラフィンを加熱ブロック内で液体になるまで加熱する。
その後、ステレオガラスパスツールピペットの助けを借りて、以前にマルチウェルに配置され、ポリD-リジンでコーティングされたカバースリップの上に小さな球を準備します。2つの培養物が接触する24時間前に、ニューロンおよびアストロサイトの培養培地を変更して、熱不活性化FBSの有無にかかわらずNBMを補う。2つの培養物を使用する準備ができたら、ニューロンを転写し、パラフィン球でカバースリップに座って、以前に70%エタノールに浸漬したピンセットを使用してアストロサイトを含むウェルに着席する。
両方の細胞タイプを接触させた後、8〜12時間待ってから、異なる刺激と手順を開始します。酸素とグルコース欠乏は、成長の7日間の培養で行われる。培養培地を取り出し、グルコース補給をせずにHBSS培地で細胞を2回洗浄する。
必ず、グルコースを含むすべての培地を洗浄してください。低酸素室を密封し、チャンバー内に存在する酸素を交換するために、20リットルの流れで95%の窒素と5%の二酸化炭素を含むガスミックスを4分間追加します。その後、流れを止め、低酸素室を37度のインキュベーターに入れます。
酸素及びグルコース欠乏の期間後、培地を交換し、グルコース補充を行わずにHBSSを残りの手順に適した培地でグルコースを補充し、細胞を37度でインキュベートする。皮質培養の種類を特徴付けるために、3種類の皮質培養で免疫体化学を行い、それぞれ乳頭細胞や神経細胞に広く用いられているGFPAまたはMAP2を発現する細胞の数を評価しました。これらの分析は、このプロトコルを使用すると、GFAPを発現する細胞の約97%を有するアストロサイトの純粋な濃縮培養物を得ることができたことを明らかにした。
ニューロンを富化培養した上で、MAP2を発現する細胞の約78%を検証した。しかし、我々は、GFAPおよびMAP2陰性細胞の約18%を同定する。ニューロングリア皮質培養に関しては、約49%の細胞がMAP2陽性であるのが観察された。
31%はGFAP陽性です。そして20%彼らはGFAPまたはMAP2に対して責任を負いません。皮質培養の確立から7日後、ニューロングリア培養およびニューロンエンリッチ培養を4時間および6時間のOGD処置を行った。
この手順の後、細胞をMAP2で標識し、次いでMAP2陽性細胞の数を蛍光顕微鏡を用いて定量した。ニューロングリア培養では、ニューロン数の約30%の減少が観察され、培養が4時間のOGD期間に提出された。OGD期間6時間後、病変の延長は増加し、ニューロン喪失の約60%に達する。
OGDに曝露したニューロンの濃縮培養について、MAP2細胞の数の約41%および64%減少が観察された。また、ニューロンエンリッチ培養では、4時間の間にOGDに曝露したニューロングリア培養と比較すると傷害延長が若干増加することが観察された。結論として、ここでは、シンプルで高速で高価で再現可能な方法で確立された虚血性脳卒中を研究するためのin vitroモデルを表します。
さらに、記載された方法はまた、ニューロンおよびアストロサイトを豊富に含む一次培養物だけでなく、ニューロングリア培養を実施することを可能にする。したがって、不死化細胞株および純粋な神経細胞またはグリア培養よりも、より高いレベルの複雑さでいくつかの脳疾患をモデル化するための素晴らしいインビトロモデルを提供する。
