Клетки CD8-T имеют различные особенности в различных тканях, как критический пример немукозальной и немфоидной ткани. Важно непосредственно охарактеризовать клетки-резиденты почек, чтобы полностью понять биологию Т-клеток. Здесь мы продемонстрируем наш удобный метод изоляции клеток CD8-T, проживающих в почках, с последующим цитометрией потока.
Этот метод может дать представление об исследованиях эффектора и памяти CD8'T клеток, генерируемых после инфекций, а также аутоиммунных реакций. Процедура будет выполнена доктором Чаою Ма, научным сотрудником моей лаборатории. Начните с разбавления биотина анти CD8 альфа-антитела до 15 микрограмм на миллилитр в PBS, убедившись, что есть достаточно, чтобы управлять 200 микролитров для каждой мыши.
Перед инъекцией нагрейте хвостовую вену мыши накладным тепловым лампой в течение пяти-десяти минут, чтобы расширить ее. Нарисуйте 200 микролитров предварительно разбавленного антитела смесь в 28-го калибра инсулина шприц и удалить любые пузырьки воздуха, перемещая поршень вверх и вниз. Согните иглу, чтобы создать 150-градусный угол между иглой и шприцем, скошенный вверх, так что игла параллельна хвостовой вене.
Сдерживайте мышь с помощью меры сдерживания грызунов и распылите хвост 70%этанолом, чтобы сделать вену хорошо видимой. Держите хвост на дистального конца большим и средним пальцами не доминирующей руки, а затем поместите указательный палец под место инъекции. С доминирующей рукой вставьте иглу в вену параллельно в направлении сердца и медленно впрыснуть 200 микролитров антитела.
Снимите иглу и аккуратно сжать место инъекции, пока кровотечение останавливается. После усыпив мышь, рассекаете почки ножницами и перенесите ее в 1,5-миллилитровую микро центрифугу. Оставьте образцы на льду до дальнейшей обработки.
Приготовьте шесть пластин с тремя миллилитров раствора пищеварения в каждой хорошо, используя один колодец на мышь, и хранить их на льду. Добавьте 300 микролитров раствора пищеварения в каждую пробную трубку и измельчите образцы почек прямыми весенними ножницами. Перенесите рубленые образцы почек на шестиясные пластины с раствором пищеварения.
Инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию с нежным качания в течение 45 минут, а затем гомогенизировать ткани с поршень фланг три миллилитров шприца и передать его в 15-миллилитровых конических труб. Спин образцов вниз на 500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в три миллилитров RPMI с 10%FCS.
Спин вниз образца в 500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, а затем удалить супернатант и повторно помыть гранулы клетки с пятью миллилитров 44%плотность градиента среднего и RPMI смеси. Положите кончик трехми миллилитров пипетки, содержащей три миллилитров 67%плотность градиента среды и PBS непосредственно в нижней части каждой трубки и медленно отпустите раствор так, что тяжелый раствор образует отдельный слой в нижней части. Спин образцов на 900 раз г в течение 20 минут с уменьшенным ускорителем и настройками тормоза, а затем тщательно удалить трубки из центрифуги, не нарушая слоев.
Удалите верхний слой с помощью переносной пипетки, не касаясь слоя лимфоцитов, и перенесите слой лимфоцитов в новую 15-миллилитровую трубку. Заполните трубку с PBS и 5%FCS, а затем смешать медленно инвертирования трубки четыре-шесть раз. После центрифугирования образцов при 500 раз G и четырех градусов по Цельсию в течение пяти минут, удалить супернатант и повторно помыть гранулы клетки с 500 микролитров полной среды RPMI.
Клетки теперь готовы к окрашивания цитометрии потока. Даже после плотности центрифугации опосредованного обогащения лимфоцитов, это было очень часто, чтобы увидеть большую часть не лимфоцитов в конечный продукт. Однако, после получения на живых лимфоцитов, CD8-T лимфоцитов было легко определить.
Как и ожидалось, только внесудистой CD8'T клетки эффективно приобрели ткани резидентов памяти Т-клеток фенотипов, таких как upregulation CD69 и downregulation Ly6C. В отличие от инфицированных мышей, подавляющее большинство клеток CD8-T, изолированных от молодых наивных мышей, размещенных в учреждении SPF, были помечены альфа-антителами CD8 и поэтому принадлежали к внутрисосудистому отсеку. Этот метод значительно ускорил исследование тканевых иммунных клеток в плотно васкуляризированных органах.
