Гемофильный грипп является основной причиной воспаления при различных хронических заболеваниях легких, включая ХОБЛ и пневмонию. Этот протокол описывает методы оценки влияния гемофилуса на воспаление легких. Преимущества этой методики заключаются в том, что она позволяет проводить комплексную оценку врожденных и адаптивных иммунных реакций.
Инкубировать 450 микролитров периферической крови с 50 микролитрами активированного йодида пропидия, меченного H influenzae, в пятимиллилитровой трубке в течение 20 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Извлеките образец из водяной бани, добавьте пять микролитров DHR и вихрь в течение 10 секунд. Затем поместите его обратно на водяную баню еще на 10 минут.
После извлечения образца с водяной бани лизируют эритроциты пятью миллилитрами 0,8% раствора хлорида аммония и анализируют образцы на проточном цитометре, как описано в тексте. Разделите образец периферической крови на аликвоты для контроля и стимуляции антигена. Добавьте костимуляторные антитела к обоим образцам.
Затем добавьте нетипичную H influenzae в образец антигена и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа. Затем добавьте блокирующий агент Гольджи брефельдин А к образцам и инкубируйте их еще в течение пяти часов. После лизирования эритроцитов, как показано ранее, зафиксируйте лейкоциты с помощью 500 микролитров от одного до 2% параформальдегида в течение одного часа.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем пронизывайте 1 миллион клеток 100 микролитрами 0,1% сапонина в течение 15 минут. Затем инкубируйте клетки с соответствующими флуоресцентно мечеными антителами. Промыть клетки, затем проанализировать их с помощью проточного цитометра.
Определите долю клеток, реагирующих на антиген, получив соответствующие популяции лимфоцитов. Выполните фоновое окрашивание на нестимулированных клетках для всех анализируемых цитокинов. Нарежьте от 20 до 40 граммов образца лобэктомии на три-пять кубических миллиметровых секций.
Поместите их внутрь стерильной 50-микролитровой камеры и механически фрагментируйте ткань с помощью соответствующего дезагрегатора. После дезагрегации тканей лизируют эритроциты, как показано, и повторно суспендируют клетки в стерильном RPMI. Затем отфильтруйте клетки через 100-микрометровую стерильную нейлоновую сетку и подсчитайте жизнеспособные клетки, используя метод исключения синего трипана.
Для анализа инфекции повторно суспендируйте клетки легких в RPMI до конечной концентрации 4 миллиона клеток на миллилитр на трубку. Затем заражайте клетки при MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте колпачок на половину оборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках.
Поместите клетки в ротатор трубки и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия, вращаясь при 12 оборотах в минуту. Через час после стимуляции добавляют грефельдин А для предотвращения внеклеточного экспорта цитокинов и инкубируют клеточные суспензии в течение еще 16-22 часов с ротацией. На следующий день промыть клеточную суспензию 500 микролитрами PBS, содержащими 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия.
Далее окрашивают клеточную суспензию для специфических маркеров клеточной поверхности лимфоцитов человека в течение одного часа. Затем промыть клетки PBS и зафиксировать и пропитать их, как показано ранее. Затем инкубируют клетки с внутриклеточными антителами окрашивания цитокинов в течение одного часа.
Затем промыть клетки и повторно суспендировать их в 100 микролитрах PBS перед сбором данных на проточном цитометре. Измерьте протеолиз с помощью действия металлопротеиназ, добавьте флуоресцеиновую меченую желатиновую подложку непосредственно на слайды среза легочной ткани. Поместите горки горизонтально и высиживайте их в защищенной светом увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.
Чтобы подготовить отрицательные контрольные элементы, добавьте один буфер х реакции без флуоресцентного желатина в секции для дальнейшего анализа. Мононуклеарные клетки периферической крови были закрыты с использованием переднего и бокового рассеяния для определения популяции фагоцитов. Популяция фагоцитов была дополнительно определена экспрессией CD14 для маркировки моноцитов.
Измерение АФК проводили путем окисления DHR 123 с получением флуоресценции. Среднюю флуоресценцию стимулированного образца сравнивали с контрольной. Внутриклеточную выработку цитокинов лимфоцитами измеряли с помощью проточной цитометрии.
Клетки были проанализированы сначала на экспрессию маркера лейкоцитов CD45, а затем на CD три и CD четыре, CD восемь. CD три, CD четыре положительные клетки были оценены на внутриклеточную продукцию цитокинов в контрольных и стимулированных образцах. Активность протеазы измеряли с помощью nc two zymography в нефиксированных участках легочной ткани.
Флуоресцентное окрашивание указывало на наличие активности MMP, которая также была солидаризирована с экспрессией хроматина. Добавление антител в образцы легочной ткани требует концентрации, а окрашивание клеток потребует оптимизации в предварительных экспериментах. Супернатант образцов легочной ткани может быть дополнительно проанализирован на предмет других медиаторов воспаления с использованием таких методов, как ИФА, и эти методы могут быть использованы для оценки влияния потенциальных методов лечения на воспаление легких.
