Пигментный эпителий сетчатки или РПЭ имеет решающее значение для здоровья сетчатки. И изучение изолированного РПЭ имеет решающее значение для заболевания сетчатки. Этот метод изоляции РПЭ от морской свинки, популярная модель близорукости, помогает в решении сложной проблемы.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост и позволяет получить высококачественный образец РПЭ, пригодный для биологических молекулярных исследований, включая анализ РПЭ. В совершенстве следуя продемонстрированной технике и наблюдая за тем, как манипулировать рассекающими инструментами, можно быстро освоить эту процедуру с некоторой практикой. После гуманной эвтаназии морской свинки и энуклеации глаз животного немедленно промыть глаза, перенеся их в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую стерильный фосфатный буферный физиологический раствор или PBS.
После промывания перенесите глаза в свежий раствор PBS. Теперь, работая под рассекающим микроскопом, используйте иглу 18-го калибра, чтобы сделать начальное небольшое отверстие в склере одного глаза, примерно на один миллиметр позади лимбальной границы между роговицей и склерой. С помощью ножниц удалите передний сегмент, включая роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело и хрусталик.
Затем, работая с оставшимся задним сегментом глаза, используйте щипцы, чтобы захватить и осторожно потянуть за зонулу Зинна, а затем отделить сетчатку от комплекса RPE / сосудистой оболочки / склеры и отслаить сетчатку без фрагментации. После того, как сетчатка будет полностью удалена, погрузите оставшуюся заднюю чашку глаза, которая включает в себя RPE, сосудистую оболочку и склеру, в одну из лунок 12-луночной пластины, содержащей два миллилитра реагента для хранения тканей, и держите ее погруженной в течение пяти минут. Чтобы смыть реагент для хранения, перенесите наглазник в другой колодец, заполненный четырьмя миллилитрами PBS, на 10 секунд, прежде чем переместить его в третью лунку, заполненную двумя миллилитрами PBS.
Прежде чем приступить к последнему этапу изоляции СИЗО, подготовьте шприц объемом один миллилитр, наполненный PBS, и прикрепите иглу 30-го калибра. Осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы создать струю PBS. Работая под микроскопом, сначала направьте этот поток PBS на СИЗОД, чтобы сделать в нем небольшой разрыв или отверстие.
Затем направьте струю PBS в созданное отверстие, чтобы отсоединить РПЭ в виде листа от сосудистой оболочки. После отделения РПЭ от сосудистой оболочки соберите клетки РПЭ в безыгольный одномиллилитровый шприц и перенесите собранный образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируют пробирку с собранным РПЭ в 8 000 х г в течение одной минуты для получения гранулы РПЭ.
Для образцов, которые будут использоваться в анализе РНК, откажитесь от надосадочной жидкости, то есть раствора PBS, и замените его 350 миллилитрами буфера для лизиса, включенного в наборы для выделения РНК. Пипетизируйте содержимое вверх и вниз 20 раз, чтобы хорошо перемешать и сохранить качество образца. Для длительного хранения и консервации перенесите образцы в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию.
Используйте набор для выделения РНК и следуйте инструкциям производителя по выделению и сбору РНК из образцов RPE перед оценкой качества образца с помощью электрофореза. В нашем исследовании собранные образцы RPE показали хорошо сохранившуюся РНК с числом целостности РНК или RIN больше восьми. Общее количество РНК составляет около 240 нанограммов на глаз.
Было обнаружено, что уровень экспрессии специфического гена RPE, Rpe65, значительно выше в образцах RPE, чем в сосудистой оболочке и склерах. Напротив, образцы RPE показали минимальную экспрессию выбранного специфического гена сосудистой оболочки склеры, альфа-она коллагенового типа, что указывает на отсутствие контаминантов хориоиды и склеры в изолированных образцах RPE. Наиболее важным этапом процедуры является плавное удаление сетчатки, не оставляя после себя ни одного фрагмента сетчатки.
Эта процедура выделения РПЭ требует объяснения исследований клеточных культур in vitro с некоторыми важными отличиями, включая выбор среды для погружения клеток РПЭ после выделения.
