В этом протоколе будет описан простой и эффективный способ успешного выделения первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши. Пигментированные клетки эпителия сетчатки играют очень важную роль в поддержании фоторецепторных клеток и обеспечении нормальной функции сетчатки. Наша лаборатория выделяет первичные пигментированные клетки эпителия мыши в качестве важного инструмента для изучения внешнего гемато-ретинального барьера и связанных с ним заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация.
Чтобы извлечь глаза мыши, этически усыпьте мышь в соответствии с утвержденными вашим учреждением методами, затем поместите мышь на стерильную нижнюю панель и зародышайте глаз, нажав пинцет в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз, затем переместите пинцет к задней части глаза и осторожно потяните, чтобы удалить глаз, гарантируя, что зрительный нерв все еще неповрежден. При использовании щипцов погружайте глаза в 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 5% повидон-йода. Инкубировать глаза при комнатной температуре в течение 2 - 3 минут.
Извлеките глаза из повидонового йода и поместите их в чашку Петри. При использовании стерильной переносной пипетки промывайте глаза сбалансированным физиологическим раствором Хэнкса до тех пор, пока оранжевый цвет повидонового йода не исчезнет. Это занимает примерно от 2 до 3 стирок.
Поместите глаза в новую чашку Петри и погрузите их в холодную полную среду роста клеток RPE. Оттуда вы можете начать рассечение под рассекающим микроскопом. Под микроскопом используйте пинцет и / или ножницы Vannas, чтобы вытянуть или отрезать соединительную ткань в экстраокулярных мышцах.
Затем глаза можно удерживать в течение часа в холодной среде культивирования клеток RPE. Однако предпочтительнее переходить непосредственно к следующему этапу после очистки глазного яблока. Переложите глаза в 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор фермента А, затем высиживают глаза внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут.
Извлеките глаза из раствора фермента А и поместите их в новую 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор фермента В, затем поместите их внутрь инкубатора и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут. Извлеките глаза из фермента В и поместите их в 60-миллиметровую чашку Петри и погрузите их и завершите RPE клеточную среду роста, затем инкубируйте глаза при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Поместите блюдо под рассекающий микроскоп и начните рассечение.
Используйте щипцы M5S и иглу шприца, чтобы сделать разрез в секции ora seratta. Теперь двумя щипцами захватите внутреннюю часть разреза одним щипцом и схватите роговицу другим щипцом. Начните медленно отрывать роговицу от сетчатки, вытягивая роговицу.
Обязательно разрывайте небольшими шагами и двигайтесь вниз по разрыву, когда вы удаляете роговицу. Это гарантирует, что RPE останется в основном нетронутым, и вы получите более чистый разрыв. Как только роговица полностью отделится, вы сможете увидеть радужную оболочку и хрусталик.
Удалите и радужную оболочку, и линзу щипцами, чтобы сохранить чистоту изоляции. Чтобы удалить нервную сетчатку из слоя RPE, захватите внешний слой глазника одним пинцетом и расположите руку второго пинцета между RPE и нейронным слоями. Оттуда осторожно потяните или зачерпните нервную сетчатку от слоя RPE, а затем отбросьте нервную сетчатку.
Переместите слой RPE в другое место на блюде, свободное от мусора. Чтобы отделить RPE от сосудистой оболочки и склеры, аккуратно соскоблите внутреннюю часть наглазника пинцетом в стиле 5/45, чтобы обеспечить разделение клеток RPE. Клетки RPE кажутся мутными при подвешенной и полной среде роста клеток RPE.
Аспирируйте клетки с помощью 3,2-миллилитровой стерильной трансферной пипетки и переносите в новую 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую полную среду роста клеток RPE. Ячейки могут быть центрифугированы при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем вы можете аспирировать супернатант и повторно использовать гранулу в подогретой среде роста клеток RPE.
Разложите ячейки на 100-миллиметровой чашке Петри и высиживайте при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Эти изображения показывают успешную изоляцию при прохождении 0 и пассаже 1, что проявляется пигментацией клеток RPE. При прохождении 4 клетки становятся менее характерными и проявляют меньше пигмента, показывают веретенообразный вид или становятся более прочными с большей площадью поверхности.
Мы проверили клетки RPE с помощью RPE-специфического маркера RPE65 и цитоскелетного белка F-актина. Мы также проверили потенциальное загрязнение клетками Мюллера, окрашивая клеточным маркером Мюллера, виментином. Данный протокол представляет собой упрощенную адаптацию существующих протоколов.
Протокол использует материалы и связанное с ними оборудование, которые доступны в большинстве исследовательских лабораторий, что поможет эффективно изолировать первичные клетки RPE мыши.
