Некодирующие РНК часто имеют несколько изоформ. В исследованиях экстракорпорального переэкспрессии часто бывает трудно изучить все эти выраженные изоформы. Этот метод позволяет пользователям получать экспрессию непосредственно из генома и позволяет клеткам выражать эндогенные изоформы для конкретной некодирующей РНК.
Этот мощный метод позволяет пользователю специально направлять экспрессию любого гена в геноме с точностью и точностью. Проектирует направляющие РНК к конкретным генам, можно использовать эндогенные генно-сращивания машины, чтобы выразить естественные изоформы в данной клетке. Демонстрацией процедуры будет Роберт Рэнкин, пост-док из моей лаборатории.
Для разработки руководства РНК последовательность, которая находится в пределах 100 базовых пар транскрипционные начала сайта, использовать генетические базы данных, такие как BLAT, чтобы убедиться, что руководство РНК является уникальным для гена интереса. Храните направляющий РНК и деактивированные плазмиды Cas9 при четырех градусах Цельсия. Streak из E.coli на лурии бульон агар пластины с ампициллином и расти бактерии ночь на 37 градусов по Цельсию.
На следующий день, выбрать колонии и расти бактерии в пяти миллилитров LB с ампициллином ночь, энергично встряхивая трубку в 37-градусный инкубатор по Цельсию. На следующий день добавьте два миллилитров бактерий в 200 миллилитров ЛБ с ампициллином в двухлитровую колбу, энергично встряхивая колбу на ночь в 37-градусном инкубаторе по Цельсию. Спин вниз бактерий на 3, 724 раз г в течение 20 минут и приступить к очистке ДНК.
Для создания dCas9-содержащих лентивирус, первый слой 100-миллилитровой ткани культуры блюда с пятью миллилитров 0,01% Поли-L-лизин и пластины пять миллионов HEK293T клеток на блюдо в 10 миллилитров полного Dulbecco в модифицированных орлов среднего, затем подготовьте образцы трансфекции ДНК, смешивая 10 микрограммов ЛТР-содержащего направляющий РНК-вектор или LTR-содержащий деактивированный вектор Cas9 с плазмидами, содержащими компоненты вирусов. Добавьте воду в общий объем 450 микролитров и отфильтруйте смесь через наконечник фильтра 0,2 микрона, прикрепленный к шприцу. Затем добавьте 50 микролитров 2,5-молярного дихлорида кальция в каждый образец трансфекции ДНК и смешайте осторожно.
Фильтр смеси кальция-ДНК через 0,2-микрон фильтр наконечник прилагается к шприцу. Пипетт 500 микролитров 2X HBS в пятими миллилитровую полистироловую трубку. Добавьте 500 микролитров смеси кальция-ДНК по капле и мягко вихрем.
Инкубировать при комнатной температуре в течение трех минут. Добавьте один миллилитр подвески HBS ДНК-кальция к каждому блюду культуры тканей HEK293T и инкубировать их в инкубаторе двуокиси углерода 5%при 37 градусах По Цельсию за одну ночь. На третий день, медленно удалить и отказаться от средств массовой информации из посуды.
Тщательно мыть клетки с PBS один раз. Добавьте шесть миллилитров полного DMEM, дополненного 20-миллимолярной HEPES и 10-миллимолярной бутиратом натрия. Затем инкубировать клетки в 5%углекислого газа инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение пяти-шести часов.
После инкубации, мыть клетки с PBS один раз и добавить пять миллилитров полного DMEM с 20-миллимолярной HEPES в HEK293T клеток. Инкубировать клетки в 5%carbon диоксида инкубатора при 37 градусов по Цельсию в течение 12 часов. На четвертый день соберите супернатанты heK293T и отфильтруй супернатант, содержащий вирус.
Для начала количество вирусных частиц сначала разбавляйте концентрат для мытья из комплекта P24 ELISA, добавляя 19 частей дистиллированной, деионизированной воды. Затем разбавьте положительный контроль от этого комплекта до 200 нанограмм на миллилитр, используя RPMI 1640 в качестве разбавления и сделайте разбавления для стандартной кривой в 1,5-миллилитровых трубках в соответствии с таблицей разбавления P24 ELISA. Для измерения концентрации вируса в образцах добавьте разбавления образца к назначенным скважинам пластины 96 скважин, начиная с 1:1000 разбавления и изменить объем по мере необходимости, чтобы быть в пределах стандартной кривой.
Затем разбавьте образцы с Triton X-100 до конечной концентрации 0,5% и добавьте 200 микролитров каждого образца и RPMI 1640 к назначенным скважинам. Печать пластины и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение двух часов. Вымойте пластину с 300 микролитров на колодец буфера 1X мыть шесть раз.
Удалите излишки жидкости, инвертирование пластины и постукивая его на бумажное полотенце. Затем добавьте 100 микролитров детекторных антител из комплекта во все скважины, кроме субстрата пустым. Печать пластины и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Вымойте тарелку, а затем удалить излишки жидкости, инвертирование пластины и нажав его на бумажное полотенце. Для того, чтобы измерить антитела детектора, разбавить стрептавидин хрен пероксидазы в 1:100 разбавления с SA-HRP разбавляют. Тщательно смешайте разбавленный SA-HRP и добавьте 100 микролитров ко всем скважинам, кроме пустых.
Печать и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем вымойте тарелку буфером для мытья 1X и оттехав любую лишнюю жидкость. Бросьте одну таблетку ортофенилендиамина в 11 миллилитров разбомбового субстрата, чтобы сделать достаточное количество субстратного раствора для одной пластины.
Vortex OPD решение энергично растворить его полностью и защитить его от света. Добавьте 100 микролитров субстратного раствора OPD ко всем скважинам, включая заготовок. Используя спектрофотометр, немедленно прочитайте абсорбанс на 450 нанометров.
Повторите 10 раз с интервалом в одну секунду и сделайте среднее измерение. Resuspend и культуры Jurkat Т-клеток в колбе T75 с плотностью одного миллиона клеток в пяти миллилитров уменьшенных средств сыворотки с полибреном. Затем добавьте HEK293T-кондиционированные средства массовой информации, содержащие один миллион dCas9-содержащих вирусных частиц.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Три дня после заражения, спина вниз клетки в 233 времени г в течение пяти минут и повторно их в 10 миллилитров полного DMEM дополняется пуромицином. Культура клеток в колбы T75 и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
Каждый третий день в течение девяти дней, спина вниз клетки в 233 раза г в течение пяти минут и заменить средства массовой информации с полным DMEM дополнен пуромицин. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Затем, на 96-хорошо пластины с тканью культуры обработанных тканей, добавить 10000 клеток в 100 микролитров полного DMEM дополняется пуромицином в первой хорошо.
Сделать 1:1 серийных разбавления содержимого следующих скважин с полным DMEM дополняется пуромицином. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Расширьте клональные клетки на две пластины из 24 колодец, затем пластина два миллиона клеток на колодец из шести хорошо пластины для трех клонов.
Плита других трех скважин с не-транс индуцированных клеток Jurkat в качестве элементов управления. Наконец, пластины клеток в колбу T75 и положить клетки в инкубатор культуры клеток на ночь. Чтобы начать количественный ПЦР для измерения экспрессии генов, сначала синтезировать комплементарную ДНК, добавив один микрограмм РНК, четыре микролитров буфера синтеза кДНК и один микролитр обратной транскриптазы до 250 микролитровых трубок, а затем добавить воду к окончательному объему 20 микролитров.
Затем используйте тепловой циклер при 42 градусах По Цельсию в течение 30 минут и при 95 градусах По Цельсию в течение пяти минут, чтобы инактивировать обратную транскриптазу. Разбавить кДНК 60 микролитров воды после синтеза. Запуск полимеразных цепных реакций для трубок, содержащих 0,5 микролитров каждого вперед и обратного грунтовки при конечной концентрации 10 микромолящих, пяти микролитров зеленого SYBR и четырех микролитров cDNA.
Наконец, выберите клетки Jurkat-dCas9 в DMEM, дополненные гигромицином B в течение 10 дней. Вращай клетки и меняй мультимедиа каждые три дня. Очисти RNAse и перейти к RT-qPCR.
В этом исследовании, gRNA последовательности, которые были в пределах от 10 до 100 базовых пар от транскрипционные стартовые площадки были использованы для направления Cas9-активации комплекса транскрипционные локус IFNG-AS1, долго некодирования РНК, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника. Для выбора двойных трансдуцированных клеток использовалась двухплазмидная система для трансдукций усилителей dCas9 или gRNAse в клетки. Здесь белки MS2 усиливают переэкспрессию IFNG-AS1.
Выражение Cas9 было подтверждено для обоих клонов. Праймеры против HPRT1 были использованы для подтверждения наличия РНК в нетрансфюсированных клетках. выражение мРНК было подтверждено, опустив обратную транскриптазу из реакции cDNA.
Три варианта сращивания IFNG-AS1 могут быть обнаружены либо с транскрипцией конкретных наборов грунтовки или грунтовки набор против всех известных IFNG-AS1 стенограммы. Все кривые флуоресценции были экспоненциальными с геном домашнего хозяйства HPRT1, достигающий экспоненциальной фазы в течение половины цикла между контроль и клетками, выражаюми МФНГ-AS1. Праймеры против всех известных транскриптов IFNG-AS1 были наиболее обнаруживаемыми между экспериментами, с измерениями 20-кратного увеличения экспрессии IFNG-AS1.
Однако третья стенограмма IFNG-AS1 показала пяти-10-кратное значительное увеличение уровня IFNG-AS1. Чтобы активно переэкспрессировать желаемый ген, дизайн направляющий РНК в шаге 2.1 имеет решающее значение для успеха протокола. Кроме того, производство качественных вирусных частиц обеспечит надежное выражение компонентов протокола.
После того, как желаемый ген переэкспрессирован, функциональные исследования могут быть выполнены для исследования генных механизмов. В нашем примере мы решили посмотреть на производство цитокинов после переэкспрессии нашего гена интереса. Этот метод был первоначально разработан Griesbach Group в 2013 году и широко применялся и разрабатывался другими группами.
Мы были рады применить этот метод к длинным некодируемых РНК для того, чтобы изучить их конкретные функции. Репликационно-дефектные лентивирусы должны быть обработаны в лаборатории, которая была одобрена для вирусной работы. Кроме того, клеточные линии человека и бактерии E.coli считаются биологически случайными.
Наконец, рекомбинантные плазмиды ДНК должны обрабатываться квалифицированным персоналом.
