Hello.Today мы покажем вам протокол, который протопластирует миллионы клеток мезофилла кукурузы и трансформирует их с высокой эффективностью. Основными этапами протокола являются сначала переваривание и удаление клеточной стенки растения, высвобождение протопластов, а затем преобразование протопласта с помощью ПЭГ. Большая разница между этим протоколом и другими заключается в масштабе преобразования.
Большинство протоколов заканчиваются от 1 000 до 10 000 трансформированных протопластов. Тем не менее, наш протокол дает миллионы трансформированных протопластов кукурузы. Здесь у нас есть рассада кукурузы, выращенная в темноте в течение девяти-11 дней после появления всходов.
Срежьте саженцы чуть выше уровня почвы и поместите в воду. Держите растения в темноте, когда они не используются. Выделите второй и третий листочки каждого саженца, стараясь исключить листья с коричневыми или поврежденными участками.
Выберите от 12 до 16 листьев и отрежьте сантиметр от кончиков. Затем отрежьте по 10 сантиметров от каждого листа. Укладывайте срезы листьев друг на друга прикорневыми концами вместе.
Зажмите пучок на базальном конце с помощью связующего зажима. Положите пучок листьев на лист белой бумаги. Нарежьте ломтики листьев шириной от 0,5 до одного миллиметра.
Важно нарезать тонкими однородными ломтиками. Отрезав часть листового пучка, переложите срезы в раствор фермента. Не допускайте высыхания материала.
Аккуратно взбейте раствор фермента, чтобы смочить материал. Положите фольгу на стакан, чтобы блокировать свет. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока весь пучок не будет срезан рядом с зажимом для переплета.
После срезки раствор должен выглядеть так. Переложите стакан с ферментным раствором в банку-колокольчик. Вакуумный инфильтрат в течение трех минут при комнатной температуре.
Инкубировать на настольном шейкере при 40 об/мин при комнатной температуре в течение двух с половиной часов. После инкубации дайте раствору покрутиться. Он должен выглядеть молочно, что свидетельствует об успешном пищеварении.
Инкубируйте на настольном шейкере при 80 об/мин при комнатной температуре еще 10 минут. Поместите стакан с ферментным раствором на лед. Остановите пищеварение, добавив один объем ледяного MMG.
Отфильтруйте через сетчатый фильтр с ячейками 40 микрон в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Разделите раствор на аликвоты не более 10 миллилитров каждая. Разлить в охлажденные стеклянные трубочки с круглым дном.
Центрифугируйте пробирки по 100 г в течение четырех минут. Удалите надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не потревожить гранулы. Ресуспендирование, затем сбор образцов для последующих промывок.
Промойте протопласты дважды пятью миллилитрами ММГ. Вращайте каждый раз на 100 G в течение трех минут. Лепешка должна быть красивого, ярко-желто-зеленого цвета.
Вы сможете ресуспендировать гранулу, осторожно вращая трубку. Ресуспендировать в одном миллилитре MMG и разбавить небольшую аликвоту от 10 до 20x для подсчета. Важно провести ресуспендирование задолго до аликутинга, так как протопласты быстро осядут.
Загрузите разведенные протопласты в гемоцитометр. Подсчитайте протопласты под световым микроскопом. Хорошая подготовка не будет иметь много лишнего мусора, плавающего после стирки.
Хорошие протопласты круглые с видимыми пластидами. Используйте количество ячеек для вычисления общего количества. Эта подготовка привела к получению чуть более 10 миллионов протопластов.
Мы рекомендуем проверять жизнеспособность с помощью флуоресцеинового диацетатного красителя. Успешное выделение протопластов дает жизнеспособность от 70 до 90%Смешайте протопласты с интересующей вас плазмидой. В этом примере используется 1 миллион протопластов и 15 микрограммов ДНК.
Инкубировать на льду 30 минут. Ресуспендируйте, постукивая по боковой стороне трубки. Добавьте раствор ПЭГ, чтобы достичь конечной концентрации 12% ПЭГ.
Аккуратно перемешайте, перевернув несколько раз. Протопласты и раствор ПЭГ хрупкие, поэтому не встряхивайте трубку. Инкубировать в темноте при комнатной температуре 10 минут.
Разбавьте пятью объемами инкубационного раствора, и аккуратно перемешайте путем инверсии. Центрифугируйте пробирки по 100 г в течение четырех минут. Промыть один раз одним миллилитровым инкубационным буфером.
Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулы. Отжимайте при 100 г в течение трех минут. Ресуспендировать в инкубационном буфере до концентрации от 500 до 1000 клеток на микролитр.
Инкубировать в темноте ночь при комнатной температуре. На следующий день отжимайте при 100 G в течение четырех минут. Дважды промыть охлажденным инкубационным раствором.
Отжимайте каждый раз на три минуты при 100 г при комнатной температуре. Ресуспендировать, затем загрузить небольшую аликвоту на гемоцитометр для окончательной проверки. Во-первых, подсчитайте общее количество протопластов под светлым полем.
Теперь понаблюдайте за фракцией протопластов, которые флуоресцируют под воздействием ультрафиолета, чтобы проверить трансфекцию. Протопласты выражают наш репортер GFP. Теперь давайте посмотрим на некоторые показатели эффективности трансфекции.
В этой подготовке мы получили 10 миллионов протопластов, из которых мы трансфицировали 1 миллион. На следующий день мы восстановили 335 000 человек. Из них у нас была скорость трансформации 30,3%, что оставляет нас в общей сложности около 100 000 протопластов, экспрессирующих GFP.
Эффективность трансфекции может варьироваться. Как вы можете видеть на диаграмме, мы обычно видим эффективность от 20 до 50% среди повторных препаратов. Этот протокол позволяет собирать и трансформировать миллионы протопластов мезофилла кукурузы.
Одной из лучших частей протокола является его способность к масштабированию. Масштабируя объем и количество протопластов, используемых при преобразовании, вы можете увеличить свою трансформацию более чем на порядок по сравнению с тем, что мы показали сегодня. На сегодняшний день наш самый большой эксперимент с одной пробиркой начался с 20 миллионов протопластов и 200 микрограммов ДНК и закончился 3,1 миллионами трансформированных протопластов на следующий день.
Этот протокол с высокой пропускной способностью особенно полезен, когда вам нужно протестировать множество различных плазмидных конструкций, но сотрудники использовали этот протокол для целей, которые не требуют возможности масштабирования, таких как проектирование синтетических генных схем и кукурузы. Спасибо, что посмотрели наше видео. Надеемся, это помогло.
