Escherichia Coli является наиболее распространенным грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение неонатального бактериального менингита чисто начинается с бактериемии, а затем бактерии в крови проникают через гемовой мозговой барьер, чтобы вызвать менингит. Нейтрофилов являются первой линией защиты от бактериальных инфекций.
Во время бактериального нашествия активные нейтрофилов высвобождает ROS. ROS представляет собой основные бактериоцидные механизмы клеток-хозяй для уничтожения вторгшихся патогенов. Измерение производства ROS в нейтрофилов является полезным методом для начала защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.
Возьмите одну бактериальную колонию из пластины со стерильной пипеткой и положите ее в пятими миллилитр brain-Heart инфузионной среды, содержащей рифампицин в вогнутой колбе. Инкубировать бактериальную культуру на 37 по Цельсию, с 90 об /мин в течение 17 часов в инкубации шейкер. Центрифуга периферических образцов крови при 2000 об/мин в течение пяти минут.
После центрифуги образцы крови делятся на три слоя. Снизу вверх, слой красных кровяных телец, слой белых кровяных телец, и плазменный слой. Аспирировать слой белых кровяных телец в новую трубку с стерильной пипеткой.
Добавьте трехкратный буфер лиза красных кровяных телец. Смешайте смесь тщательно, и место при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифуга трубки при 2000 об/мин в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант полностью и отказаться. Повторите процедуру лиза эритроцитов в течение одного или двух раз, пока осадки не побелеет. Вымойте клетки, повторно приостановив осадок с двумя миллилитров PBS.
Затем центрифуга трубки при 1000 об/мин в течение пяти минут. Перерасходовать осадок с 15 микролитер прекод магнитных ячеек сортировки буфера для 15 миллионов клеток. Добавьте 15 магнитных микробусов микролитров и тщательно перемешайте.
Инкубировать смесь по четыре по Цельсию в течение 30 минут. В нормальных условиях у взрослого человека есть от четырех до 10 000 белых кровяных телец на микролитерную кровь. Таким образом, стоимость общих белых кровяных телец в пяти миллилитров человеческой периферической крови, почти менее 50 миллионов.
И 50 микролитров магнитных бусин в 15 микролитров магнитной сортировки буфера достаточно. Нормальный процент нейтрофилов составляет от 50 до 70% от общего количества белых кровяных телец. Таким образом, около 10 миллионов нейтрофилов могут быть получены из пяти миллилитров крови.
Вымойте клетки, добавив два миллилитров магнитного буфера сортировки, на 10 миллионов клеток в трубку, и центрифуги на четыре по Цельсию, 1200 об /мин в течение 10 минут. Соберите магнитную колонку и разделив полку. Отбросьте супернатант полностью, и resuspend отложения с 500 микролитер магнитного буфера сортировки до 100 миллионов клеток.
Промыть столбец с помощью трехмилитрового магнитного буфера сортировки. Нанесите подвеску клетки на колонку, чтобы нейтрофиловы, помеченные магнитными бусинами, прикреплялись к столбецу. Смыл неспецифические специфические ячейки, добавив три миллилитровых буфера в течение трех раз, как только столбец резервуар пуст каждый раз.
Снимите столбец с магнитного сепаратора и поместите его в новую трубку. Добавьте в столбец пятими миллилитровый буфер магнитной сортировки. Выталкивайте магнитные помеченные клетки с помощью поршеня.
Центрифуга трубки при 1200 об/мин в течение пяти минут. Аспирировать супернатант полностью, и повторно изложения отложений с одной миллилитр культуры среды. Определите номер ячейки с помощью счетчика.
Скорректирована концентрация клеток до 2 миллионов на миллилитр в среде культуры, содержащей зонд DHE флуоресценции. Поместите нейтрофилов в инкубатор на 30 минут, чтобы загрузить зонд DHE. Выделите подвеску ячейки на черную микроплюжнику на 96 колодец с 200 микролитров на колодец.
Включите считыватель микроплатформ. Установите температуру до 37 градусов по Цельсию, выберите режим чтения флуоресценции, кинетический тип чтения, установите длину волны флуоресценции. Выберите формат пластины.
Определите область чтения. Измерьте интенсивность флуоресценции каждые пять минут в течение часа. Встряхните тарелку в течение трех секунд перед каждым чтением.
Вынюхив микроплюс из инкубатора. Добавьте штаммы PMA или E44 с тремя повторениями. Положите пластину в считыватель микропластиц, нажмите кнопку запуска, чтобы начать анализ немедленно.
Используя наброски протокола в этой статье, нейтрофили были выделены из периферической крови человека и загружены зондом DHE с флуоресценцией. Добавив PMA, внутриклеточный ROS в нейтрофилов, показал значительное увеличение от 20 до 40 минут, и достиг пика в 60 минут. Но я думаю, E44 штаммов, ROS производство происходит сразу и увеличивает время в зависимости.
Выражение ROS, вызванное штаммом E44, аналогично выражению, вызванному PMA. Обнаружение производства ROS в нейтрофилах может способствовать дальнейшему изучению бактериоцидных механизмов нейтрофилов. В этом протоколе мы предоставляем более простой способ обнаружения производства ROS в нейтрофилах в режиме реального времени.
Простой метод может также использоваться для мониторинга производства ROS в других типах клеток хостов во время взаимодействия хост-бактерий.
