Ганглиозиды экспрессируются на всех клеточных поверхностях позвоночных и особенно распространены на нервных клетках. Они регулируют клеточную сигнализацию и распознавание клеток-клеток. Этот протокол вводит выделение и анализ ганглиозидов.
Методы были выбраны для максимизации выхода ганглиозидов в больших и малых масштабах при одновременной оптимизации очистки. Мы также описываем методы относительно быстрого выполнения качественного и полуколичественного анализа ганглиозидов. Изучение липидов, особенно полярных липидов, таких как ганглиозиды, требует других инструментов и методов, чем работа с белками или нуклеиновыми кислотами.
Это видео познакомит вас с тем, как работать с этими молекулами. Поскольку растворители, такие как хлороформ и тетрагидрофуран, растворяют обычные пластмассы, мы используем стеклянные бутылки и флаконы с тефлоновыми крышками, стеклянные пипетки, стекло, микрошприцы из нержавеющей стали и гомогенизаторы тефлонового стекла во время этих процедур. Неспособность сделать это приводит к образованию пластиковых полимеров в продуктах, которые могут мешать анализу.
Для начала добавьте 4,1 миллилитра воды на грамм ткани влажной массы, и гомогенизируйте ее 10 ударами. Добавьте 13 миллилитров метанола на грамм ткани. Переложите его до температуры окружающей среды 22 градуса Цельсия и перемешайте.
Переложите ткань в толстостенную стеклянную завинчивающуюся трубку с завинчивающейся крышкой из PTFE и тщательно перемешайте. Добавьте 6,5 миллилитров хлороформа на грамм ткани, колпачкайте его и тщательно перемешайте. Центрифуга по 450 раз г в течение 15 мин.
Затем перенесите прозрачный супернатант в свежую трубку с завинчивающейся крышкой и измерьте объем как восстановленный объем экстракта. Для разделения добавьте в 0,173 раза больше восстановленного объема экстракта воды к прозрачному супернатанту. Затем закройте его крышкой.
Вихрь энергично. Центрифуга по 450 раз г в течение 15 мин. Перенесите верхнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в свежую стеклянную трубку с винтовой крышкой, облицованной PTFE.
Для выполнения обратнофазной картриджной хроматографии используйте пятимиллилитровой стеклянный шприц для промывки твердофазного экстракционного картриджа tC18 тремя миллилитрами метанола. Затем добавляют три миллилитра хлороформа-метанола-воды в соотношении два к 43 к 55. Загрузите верхнюю фазу с предыдущего шага на картридж tC18 через тот же стеклянный шприц.
Соберите сквозной поток и перезагрузите его на столбец, чтобы оптимизировать адсорбцию. Промыть картридж тремя миллилитрами хлороформ-метанол-воды, а затем тремя миллилитрами метаноловой воды. Элюируйте ганглиозиды тремя миллилитрами метанола в свежую трубку с завинчивающейся крышкой.
Испаряются до сухости под мягким потоком азота при температуре менее или равной 45 градусам Цельсия. Растворяют в метаноле по одному миллилитру на грамм исходной ткани влажной массы. Поместите 100 граммов серого вещества мозга в блендер и добавьте один миллилитр на грамм мозговой влаги охлажденного 10-миллимолярного фосфатного буфера калия рН 6,8.
Затем гомогенизировать на низком уровне в течение 20 секунд. Добавьте восемь миллилитров тетрагидрофурана на грамм мозгового влажного веса и гомогенизируйте на низком уровне в течение 10 секунд. Декантировать в стеклянные бутылки-центрифуги и центрифугу по 5 000 г в течение 15 минут.
Соберите супернатант, измерьте его объем, а затем перенесите его в стеклянную сепараторную воронку. Добавьте 0,3 миллилитра этилового эфира на миллилитр супернатанта. Энергично встряхните.
Затем дайте ему спокойно постоять в течение 30 минут, в течение которых две фазы, верхняя эфирная фаза и нижняя водная фаза, разделяются. Соберите нижнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE. К верхней эфирной фазе, остающейся в сепараторной воронке, добавляют 0,1 миллилитра воды на миллилитр исходного супернатанта с предыдущей стадии.
Энергично встряхните. Разрешите фазам разделяться. Затем соберите нижнюю водную фазу и соедините ее с ранее собранной нижней фазой.
Испарите комбинированные нижние фазы в сухой порошок и взвесьте его. Для выполнения обратнофазной хроматографии предварительно промывайте крупномасштабную твердофазную экстракционную картриджную картридж tC18, пропуская 50 миллилитров растворителей через колонну с использованием вакуума или давления менее одной минуты на промывку. Загрузите верхнюю фазу из разделения фаз после омыления на колонну вакуумом или давлением.
Затем соберите сквозной поток, перезагрузите его и снова соберите поток для последующего анализа. Промойте колонку по 30 миллилитров хлороформ-метанол-вода, а затем метанол-вода. Затем элюируют ганглиозиды 50 миллилитрами метанола, а затем снова 10 миллилитрами метанола.
Соберите каждую стирку и элюирование отдельно. Используйте тонкослойную хроматографию, или TLC, чтобы подтвердить, что ганглиозиды отсутствуют в протекании и промываются и элюируются при первом элюировании метанола. Испарите элюированные ганглиозиды в сухой порошок и взвесьте их.
Для выполнения TLC налейте работающий растворитель в стеклянную камеру TLC размером 10 на 10 сантиметров с крышкой из нержавеющей стали таким образом, чтобы глубина растворителя составляла 0,5 сантиметра. Накройте камеру и дайте ей уравновеситься в течение примерно 10 минут. Вымойте 10-микролитровый шприц Гамильтона скошенной иглой с использованием метанола.
Нарисуйте один микролитр метанола в стеклянный шприц, чтобы заполнить мертвый объем иглы, а затем один микролитр образца или стандартного. Равномерно нанесите образец на пятимиллиметровые предварительно отмеченные линии до тех пор, пока в шприце не останется менее одного микролитра растворителя метанола. Дайте пластине высохнуть при 22 градусах Цельсия после того, как все образцы будут замечены.
Поместите пятнистую и высушенную пластину в предварительно уравновешенную камеру TLC с нижним краем, погруженным в работающий растворитель. Позвольте работающему растворителю продвинуться вверх по пластине капиллярным действием до тех пор, пока передняя часть растворителя не достигнет одного сантиметра от верхней части пластины. Снимите и пометьте карандашом переднюю часть растворителя по краю пластины.
Позвольте растворителям полностью испаряться либо без помех, либо под мягким потоком воздуха. В химическом вытяжном шкафу поместите пластину TLC с разрешенным концом ганглиозидов вверх ногами в вырезанную картонную коробку, чтобы защитить стенки вытяжки от кислотного распыления. Поместите реагент спрея реагента реагента в стеклянный распылитель TLC.
Прикрепите его к источнику азота под давлением, и слегка распылите пластину по диагонали в вертикальном и горизонтальном направлениях. Немедленно накройте пластину чистой, сухой стеклянной крышкой тех же размеров и закрепите крышку на месте связующими зажимами. Нагрейте накрытую тарелку при 125 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Ганглиозиды будут казаться темно-фиолетовыми на белом фоне. Для выполнения липидного окрашивания опустите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами стороной вниз в стакан, содержащий анизальдегидное пятно. Погрузитесь в бегущий фронт чуть более чем на две секунды.
Затем дайте ему стечь. Нагревайте пластину TLC на конфорке при низкой температуре для развития. Этот протокол обеспечивает ганглиозиды в достаточном количестве и чистоте для качественного и количественного определения.
Разрешение TLC в один микролитр обеспечивает достаточный материал для обнаружения резорцина и разрешает все основные ганглиозиды мозга для диких и генетически модифицированных мышей. Хотя полученные смешанные ганглиозиды не свободны от других основных липидов, они имеют достаточную чистоту для масс-спектрометрического определения либо в виде нативных очищенных ганглиозидов в отрицательном режиме, либо после предварительного метилирования в положительном режиме. Крупномасштабная очистка включает экстракцию, омыление и разрешение ВЭЖХ для обеспечения очищенных основных ганглиозидов мозга, пригодных для биологических экспериментов и для дальнейших химических и ферментативных модификаций.
Показан примерный профиль ВЭЖХ и последующий анализ TLC. Щелочная обработка, или омыление, необходима для гидролиза и удаления загрязняющих фосфолипидов, но также гидролизует естественные модификации ганглиозидов, такие как O-ацетилированные сиаловые кислоты, которые могут быть важны в некоторых контекстах. Точные соотношения растворителей для экстракции, разделения растворителей и разрешения TLC имеют решающее значение для повышения извлечения, чистоты и анализа.
От рака до метаболизма и функции мозга, ганглиозиды являются физиологическими модификаторами и терапевтическими мишенями. Выделение, очистка и анализ ганглиозидов являются краеугольными камнями для биомедицинских открытий и терапевтических разработок.
