Los gangliósidos se expresan en todas las superficies celulares de los vertebrados y son especialmente abundantes en las células nerviosas. Regulan la señalización celular y el reconocimiento célula-célula. Este protocolo introduce el aislamiento y análisis de gangliósidos.
Las técnicas se seleccionaron para maximizar los rendimientos de gangliósidos a grandes y pequeñas escalas al tiempo que se racionalizaba la purificación. También se describen métodos para realizar con relativa rapidez análisis de gangliósidos cualitativos y semicuantitativos. El estudio de lípidos, especialmente lípidos polares como los gangliósidos, requiere herramientas y técnicas diferentes a las de trabajar con proteínas o ácidos nucleicos.
Este video lo familiariza con cómo trabajar con estas moléculas. Debido a que los solventes como el cloroformo y el tetrahidrofurano disuelven los plásticos comunes, utilizamos botellas y viales de vidrio con tapas forradas de teflón, pipetas de vidrio, vidrio, microjeringes de acero inoxidable y homogeneizadores de vidrio de teflón a lo largo de estos procedimientos. De lo contrario, se producen polímeros plásticos en los productos que pueden interferir con los análisis.
Para empezar, añade 4,1 mililitros de agua por gramo de peso húmedo de tejido, y homogeneiza con 10 golpes. Añadir 13 mililitros de metanol por gramo de tejido. Transfiéralo a una temperatura ambiente de 22 grados centígrados y mezcle.
Transfiera el tejido a un tubo de paredes gruesas, de vidrio y tapón de rosca con una tapa de rosca forrada de PTFE y mezcle bien. Agregue 6.5 mililitros de cloroformo por gramo de tejido, cúbralo y mezcle bien. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos.
Luego transfiera el sobrenadante transparente a un tubo fresco con tapa de rosca y mida el volumen como volumen de extracto recuperado. Para la partición, agregue 0.173 veces el volumen de agua de extracto recuperado al sobrenadante claro. Luego cúbrelo.
Vórtice vigorosamente. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos. Transfiera la fase superior, que contiene los gangliósidos, a un tubo de vidrio fresco con una tapa de rosca forrada de PTFE.
Para realizar cromatografía de cartucho de fase inversa, use una jeringa de vidrio de cinco mililitros para lavar un cartucho de extracción de fase sólida tC18 con tres mililitros de metanol. Luego agregue tres mililitros de cloroformo-metanol-agua en una proporción de dos a 43 a 55. Cargue la fase superior del paso anterior en el cartucho tC18 a través de la misma jeringa de vidrio.
Recopile el flujo y vuelva a cargarlo en la columna para optimizar la adsorción. Lave el cartucho con tres mililitros de cloroformo-metanol-agua y luego con tres mililitros de metanol-agua. Eluya los gangliósidos con tres mililitros de metanol en un tubo fresco con tapa de rosca.
Evaporar a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno a una temperatura menor o igual a 45 grados centígrados. Disolver en metanol a un mililitro por gramo de peso húmedo del tejido original. Coloque 100 gramos de materia gris cerebral en una licuadora y agregue un mililitro por gramo de peso húmedo cerebral de tampón de fosfato de potasio 10 milimolar refrigerado de pH 6.8.
Luego homogeneizar en baja durante 20 segundos. Agregue ocho mililitros de tetrahidrofurano por gramo de peso húmedo cerebral y homogeneice a baja temperatura durante 10 segundos. Decantar en botellas de centrífuga de vidrio, y centrifugar a 5. 000 veces g durante 15 minutos.
Recoja el sobrenadante, mida su volumen y luego transfiéralo a un embudo separador de vidrio. Añadir 0,3 mililitros de éter etílico por mililitro del sobrenadante. Agitar vigorosamente.
Luego deje que se asiente sin ser molestado durante 30 minutos, durante los cuales se separan dos fases, una fase superior del éter y una fase acuosa inferior. Recoja la fase inferior, que contiene los gangliósidos, en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE. A la fase superior de éter que queda en el embudo separador, agregue 0,1 mililitros de agua por mililitro de sobrenadante original del paso anterior.
Agitar vigorosamente. Permita que las fases se separen. Luego recoja la fase acuosa inferior y combínela con la fase inferior previamente recolectada.
Evaporar las fases inferiores combinadas a un polvo seco y pesarlo. Para realizar cromatografía de fase inversa, prelavado de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 a gran escala pasando 50 mililitros de disolventes a través de la columna utilizando vacío o presión durante menos de un minuto por lavado. Cargue la fase superior desde la separación de la fase posterior a la saponificación en la columna por vacío o presión.
A continuación, recoja el flujo a través, vuelva a cargarlo y vuelva a recoger el flujo para su posterior análisis. Lave la columna con 30 mililitros cada uno de cloroformo-metanol-agua, seguido de metanol-agua. Luego eluya los gangliósidos con 50 mililitros de metanol y luego nuevamente con 10 mililitros de metanol.
Recoge cada lavado y elución por separado. Use cromatografía de capa delgada, o TLC, para confirmar que los gangliósidos están ausentes del flujo y lavados y eluidos en la primera elución de metanol. Evaporar los gangliósidos eluidos a un polvo seco y pesarlos.
Para realizar TLC, vierta el disolvente corriente en una cámara TLC de vidrio de 10 por 10 centímetros con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de 0,5 centímetros. Cubra la cámara y deje que se equilibre durante unos 10 minutos. Lave una jeringa Hamilton de 10 microlitros con una aguja biselada con metanol.
Extraiga un microlitro de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego un microlitro de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de cinco milímetros hasta que quede menos de un microlitro de disolvente de metanol en la jeringa. Deje que la placa se seque a 22 grados centígrados después de que se detecten todas las muestras.
Coloque la placa manchada y seca sobre la cámara TLC preequilibrada con el borde inferior sumergido en el disolvente de funcionamiento. Permita que el disolvente en funcionamiento avance hacia arriba de la placa por acción capilar hasta que el frente del disolvente alcance dentro de un centímetro de la parte superior de la placa. Retire y marque el frente del disolvente en el borde de la placa con un lápiz.
Permita que los disolventes se evaporen completamente, ya sea sin perturbaciones o bajo un flujo de aire suave. En una campana de humos químicos, coloque la placa TLC con el extremo de origen de gangliósidos resuelto boca abajo en una caja de cartón cortada para proteger las paredes de la campana del aerosol ácido. Coloque el reactivo de pulverización de resorcinol en un pulverizador TLC de vidrio.
Adjúntelo a una fuente de nitrógeno presurizado y rocíe ligeramente la placa en diagonal en las direcciones vertical y horizontal. Cubra inmediatamente la placa con una placa de cubierta de vidrio limpia y seca de las mismas dimensiones, y asegure la placa de cubierta en su lugar con clips de aglutinante. Calentar la placa cubierta a 125 grados centígrados durante 20 minutos.
Los gangliósidos aparecerán de color púrpura oscuro sobre un fondo blanco. Para realizar la tinción lipídica, sumerja la placa TLC con el origen de gangliósidos resueltos de lado hacia abajo en un vaso de precipitados que contenga la tinción de anisaldehído. Sumérgete en el frente de carrera durante poco más de dos segundos.
Luego deje que drene. Calentar la placa TLC en una placa caliente a baja temperatura para que se desarrolle. Este protocolo proporciona gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa.
La resolución TLC de un microlitro proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cerebrales para ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados. Aunque los gangliósidos mixtos preparados no están libres de otros lípidos importantes, son de suficiente pureza para la determinación espectrométrica de masas, ya sea como gangliósidos purificados nativos en modo negativo o después de la premetilación en modo positivo. La purificación a gran escala incluye extracción, saponificación y resolución de HPLC para proporcionar gangliósidos cerebrales principales purificados adecuados para experimentos biológicos y para modificaciones químicas y enzimáticas adicionales.
Se muestra un perfil de HPLC ejemplar y el posterior análisis de TLC. El tratamiento alcalino, o saponificación, es necesario para hidrolizar y eliminar los fosfolípidos contaminantes, pero también hidrolizará las modificaciones naturales de los gangliósidos, como los ácidos siálicos O-acetilados, que pueden ser importantes en algunos contextos. Las proporciones precisas de disolventes para la extracción, la partición de disolventes y la resolución de TLC son fundamentales para mejorar la recuperación, la pureza y los análisis.
Desde el cáncer hasta el metabolismo y la función cerebral, los gangliósidos son modificadores fisiológicos y objetivos terapéuticos. El aislamiento gangliósido, la purificación y los análisis son piedras angulares para el descubrimiento biomédico y el desarrollo terapéutico.
