I gangliosidi sono espressi su tutte le superfici cellulari dei vertebrati e sono particolarmente abbondanti sulle cellule nervose. Regolano la segnalazione cellulare e il riconoscimento cellula-cellula. Questo protocollo introduce l'isolamento e l'analisi dei gangliosidi.
Le tecniche sono state selezionate per massimizzare le rese di ganglioside su larga e piccola scala, semplificando al contempo la purificazione. Descriviamo anche metodi per eseguire relativamente rapidamente analisi gangliosidiche qualitative e semiquantitative. Lo studio sui lipidi, in particolare i lipidi polari come i gangliosidi, richiede strumenti e tecniche diversi rispetto al lavoro con proteine o acidi nucleici.
Questo video ti familiarizza con come lavorare con queste molecole. Poiché solventi come il cloroformio e il tetraidrofurano dissolvono le plastiche comuni, utilizziamo bottiglie e fiale di vetro con tappi rivestiti in teflon, pipette di vetro, vetro, microsiringhe in acciaio inossidabile e omogeneizzatori di vetro teflon in tutte queste procedure. In caso contrario, nei prodotti si verificano polimeri plastici che possono interferire con le analisi.
Per iniziare, aggiungi 4,1 millilitri di acqua per grammo di peso umido del tessuto e omogeneizzalo con 10 colpi. Aggiungere 13 millilitri di metanolo per grammo di tessuto. Trasferirlo a una temperatura ambiente di 22 gradi Celsius e mescolare.
Trasferire il tessuto in un tubo di vetro a parete spessa con tappo a vite con un tappo a vite rivestito in PTFE e mescolare accuratamente. Aggiungere 6,5 millilitri di cloroformio per grammo di tessuto, tapparlo e mescolare accuratamente. Centrifugare a 450 volte g per 15 minuti.
Quindi trasferire il surnatante trasparente in un tubo fresco con tappo a vite e misurare il volume come volume di estratto recuperato. Per il partizionamento, aggiungere 0,173 volte il volume d'acqua estratto recuperato al surnatante trasparente. Quindi coprilo.
Vortice vigorosamente. Centrifugare a 450 volte g per 15 minuti. Trasferire la fase superiore, che contiene i gangliosidi, in un tubo di vetro fresco con un tappo a vite rivestito in PTFE.
Per eseguire la cromatografia a cartuccia inversa, utilizzare una siringa di vetro da cinque millilitri per lavare una cartuccia di estrazione a fase solida tC18 con tre millilitri di metanolo. Quindi aggiungere tre millilitri di cloroformio-metanolo-acqua con un rapporto di due a 43 a 55. Caricare la fase superiore del passaggio precedente sulla cartuccia tC18 attraverso la stessa siringa di vetro.
Raccogli il flusso passante e ricaricalo sulla colonna per ottimizzare l'adsorbimento. Lavare la cartuccia con tre millilitri di cloroformio-metanolo-acqua e poi con tre millilitri di metanolo-acqua. Eluire i gangliosidi con tre millilitri di metanolo in un tubo fresco con tappo a vite.
Evaporare a secco sotto un leggero flusso di azoto a una temperatura inferiore o uguale a 45 gradi Celsius. Sciogliere in metanolo a un millilitro per grammo di peso umido del tessuto originale. Metti 100 grammi di materia grigia cerebrale in un frullatore e aggiungi un millilitro per grammo di peso umido cerebrale di tampone di fosfato di potassio refrigerato da 10 millimolari di pH 6,8.
Quindi omogeneizzare in basso per 20 secondi. Aggiungere otto millilitri di tetraidrofurano per grammo di peso umido del cervello e omogeneizzare a basso per 10 secondi. Decantare in bottiglie di centrifughe di vetro e centrifugare a 5.000 volte g per 15 minuti.
Raccogliere il surnatante, misurarne il volume e quindi trasferirlo in un imbuto separatore di vetro. Aggiungere 0,3 millilitri di etere etilico per millilitro del surnatante. Agitare vigorosamente.
Quindi lasciarlo riposare indisturbato per 30 minuti, durante i quali due fasi, una fase eterea superiore e una fase acquosa inferiore, si separano. Raccogliere la fase inferiore, che contiene i gangliosidi, in una bottiglia di vetro con un tappo rivestito in PTFE. Alla fase etere superiore che rimane nell'imbuto separatore, aggiungere 0,1 millilitri di acqua per millilitro di surnatante originale del passaggio precedente.
Agitare vigorosamente. Consenti la separazione delle fasi. Quindi raccogliere la fase acquosa inferiore e combinarla con la fase inferiore precedentemente raccolta.
Evaporare le fasi inferiori combinate in una polvere secca e pesarla. Per eseguire la cromatografia inversa, prelavare una cartuccia di estrazione a fase solida tC18 su larga scala facendo passare 50 millilitri di solventi attraverso la colonna usando il vuoto o la pressione per meno di un minuto per lavaggio. Caricare la fase superiore dalla separazione di fase post-saponificazione sulla colonna per vuoto o pressione.
Quindi raccogliere il flusso attraverso, ricaricarlo e raccogliere nuovamente il flusso per l'analisi successiva. Lavare la colonna con 30 millilitri ciascuno di cloroformio-metanolo-acqua, seguita da metanolo-acqua. Quindi eluire i gangliosidi con 50 millilitri di metanolo e poi di nuovo con 10 millilitri di metanolo.
Raccogliere ogni lavaggio ed eluizione separatamente. Utilizzare la cromatografia a strato sottile, o TLC, per confermare che i gangliosidi sono assenti dal flusso e lavati ed eluiti nella prima eluizione di metanolo. Evaporare i gangliosidi eluiti in una polvere secca e pesarli.
Per eseguire TLC, versare il solvente in esecuzione in una camera TLC di vetro di 10 x 10 centimetri con una copertura in acciaio inossidabile in modo che la profondità del solvente sia di 0,5 centimetri. Coprire la camera e lasciarla equilibrare per circa 10 minuti. Lavare una siringa Hamilton da 10 microlitri con un ago smussato usando metanolo.
Aspirare un microlitro di metanolo in una siringa di vetro per riempire il volume morto dell'ago e poi un microlitro di campione o standard. Individuare il campione in modo uniforme sulle linee premarcate di cinque millimetri fino a quando nella siringa rimane meno di un microlitro di solvente a metanolo. Lasciare asciugare la piastra a 22 gradi Celsius dopo che tutti i campioni sono stati individuati.
Posizionare la piastra maculata e asciugata sulla camera TLC preequilibrata con il bordo inferiore immerso nel solvente in esecuzione. Lasciare che il solvente in esecuzione avanzi sulla piastra per azione capillare fino a quando il fronte del solvente raggiunge entro un centimetro dalla parte superiore della piastra. Rimuovere e contrassegnare la parte anteriore del solvente sul bordo del piatto con una matita.
Lasciare evaporare completamente i solventi indisturbati o sotto un flusso d'aria mite. In una cappa aspirante chimica, posizionare la piastra TLC con l'estremità risolta dei gangliosidi a testa in giù in una scatola di cartone tagliata per proteggere le pareti della cappa dallo spruzzo acido. Posizionare il reagente spray resorcinolo in uno spruzzatore TLC di vetro.
Attaccarlo a una fonte di azoto pressurizzato e spruzzare leggermente la piastra in diagonale nelle direzioni verticale e orizzontale. Coprire immediatamente la piastra con una piastra di copertura in vetro pulita, asciutta e delle stesse dimensioni e fissare la piastra di copertura in posizione con clip leganti. Riscaldare la piastra coperta a 125 gradi Celsius per 20 minuti.
I gangliosidi appariranno viola scuro su uno sfondo bianco. Per eseguire la colorazione lipidica, immergere la piastra TLC con l'origine dei gangliosidi risolti verso il basso in un becher contenente la macchia di anisaldeide. Immergiti nella parte anteriore in corsa per poco più di due secondi.
Quindi lasciarlo scolare. Riscaldare la piastra TLC su una piastra calda a bassa temperatura per svilupparsi. Questo protocollo fornisce gangliosidi in quantità e purezza sufficienti per la determinazione qualitativa e quantitativa.
La risoluzione TLC di un microlitro fornisce ampio materiale per il rilevamento del resorcinolo e risolve tutti i principali gangliosidi cerebrali per topi selvatici e geneticamente modificati. Sebbene i gangliosidi misti preparati non siano privi di altri lipidi principali, sono di purezza sufficiente per la determinazione spettrometrica di massa sia come gangliosidi purificati nativi in modalità negativa che dopo pre-metilazione in modalità positiva. La purificazione su larga scala comprende l'estrazione, la saponificazione e la risoluzione HPLC per fornire gangliosidi cerebrali principali purificati adatti per esperimenti biologici e per ulteriori modifiche chimiche ed enzimatiche.
Viene mostrato un profilo HPLC esemplare e la successiva analisi TLC. Il trattamento alcalino, o saponificazione, è necessario per idrolizzare e rimuovere i fosfolipidi contaminanti ma idrolizzerà anche le modificazioni naturali dei gangliosidi come gli acidi sialici O-acetilati, che possono essere importanti in alcuni contesti. Rapporti solventi accurati per l'estrazione, la suddivisione del solvente e la risoluzione TLC sono fondamentali per migliorare il recupero, la purezza e le analisi.
Dal cancro al metabolismo alla funzione cerebrale, i gangliosidi sono modificatori fisiologici e bersagli terapeutici. L'isolamento, la purificazione e l'analisi del ganglioside sono pietre miliari per la scoperta biomedica e lo sviluppo terapeutico.
