강글리오사이드는 모든 척추동물 세포 표면에서 발현되며 특히 신경 세포에 풍부합니다. 그들은 세포 신호 전달 및 세포 세포 인식을 조절합니다. 이 프로토콜은 강글리오사이드 분리 및 분석을 소개합니다.
이 기술은 정제를 간소화하면서 크고 작은 규모로 강글리오사이드 수율을 극대화하기 위해 선택되었습니다. 우리는 또한 질적 및 반정량적 강글리오사이드 분석을 비교적 신속하게 수행하는 방법을 설명합니다. 지질, 특히 강글리오사이드와 같은 극성 지질에 대한 연구는 단백질이나 핵산으로 작업하는 것보다 다른 도구와 기술을 필요로합니다.
이 비디오는 이러한 분자로 작업하는 방법을 알려줍니다. 클로로포름 및 테트라히드로푸란과 같은 용매는 일반적인 플라스틱을 용해시키기 때문에, 우리는 테프론 라이닝된 캡, 유리 피펫, 유리, 스테인리스 스틸 마이크로사이어, 테프론 유리 균질기가 있는 유리 병과 바이알을 이러한 절차 전반에 걸쳐 사용합니다. 그렇게하지 않으면 제품의 플라스틱 폴리머가 분석을 방해 할 수 있습니다.
시작하려면 조직 젖은 무게 그램 당 4.1 밀리리터의 물을 넣고 10 스트로크로 균질화하십시오. 조직 그램 당 13 밀리리터의 메탄올을 첨가하십시오. 섭씨 22 도의 주변 온도로 옮기고 혼합하십시오.
조직을 PTFE가 늘어선 스크류 캡이있는 두꺼운 벽의 유리, 나사 캡 튜브로 옮기고 완전히 혼합하십시오. 조직 그램 당 6.5 밀리리터의 클로로포름을 넣고 뚜껑을 덮고 완전히 섞으십시오. 450배 g에서 15분 동안 원심분리한다.
그 다음 맑은 상청액을 신선하고 나사로 덮인 튜브로 옮기고 회수 된 추출물 부피로 부피를 측정하십시오. 분할을 위해, 회수된 추출 부피의 0.173배의 물을 투명한 상청액에 첨가한다. 그런 다음 뚜껑을 덮으십시오.
격렬하게 소용돌이. 450배 g에서 15분 동안 원심분리한다. 강글리오사이드가 들어있는 상층을 PTFE가 늘어선 스크류 캡이 있는 신선한 유리 튜브로 옮깁니다.
역상 카트리지 크로마토그래피를 수행하려면 5밀리리터 유리 주사기를 사용하여 tC18 고체상 추출 카트리지를 세 밀리리터의 메탄올로 세척합니다. 그런 다음 클로로포름 - 메탄올 - 물 3 밀리리터를 두 ~ 43 ~ 55의 비율로 첨가하십시오. 이전 단계의 상부 상을 동일한 유리 주사기를 통해 tC18 카트리지에 로드합니다.
플로우스루를 수집하고 컬럼에 다시 로드하여 흡착을 최적화합니다. 카트리지를 세 밀리리터의 클로로포름-메탄올-물로 세척한 다음 세 밀리리터의 메탄올-물로 세척하십시오. 세 밀리리터의 메탄올로 신경절을 뭉개어 신선한 나사 뚜껑이 달린 튜브에 넣습니다.
섭씨 45도 이하의 온도에서 부드러운 질소 흐름 하에서 건조로 증발하십시오. 원래 조직 습윤 중량의 그램 당 한 밀리리터로 메탄올에 용해시킨다. 블렌더에 뇌 회색 물질 100 그램을 넣고 pH 6.8의 냉장 10 밀리몰 인산 칼륨 버퍼의 뇌 습윤 중량 그램 당 1 밀리리터를 첨가하십시오.
그런 다음 20 초 동안 낮게 균질화하십시오. 그램 당 테트라 하이드로 퓨란의 8 밀리리터를 뇌 습윤 중량을 첨가하고, 10 초 동안 낮게 균질화하십시오. 유리 원심분리기 병에 데칸트를 넣고, 5, 000배 g에서 15분 동안 원심분리한다.
상층액을 수집하고 부피를 측정 한 다음 유리 분리 깔때기로 옮깁니다. 상청액의 밀리리터 당 0.3 밀리리터의 에틸 에테르를 첨가하십시오. 격렬하게 흔들어 주십시오.
그런 다음 30 분 동안 방해받지 않고 앉아있게하고, 그 동안 두 단계, 상부 에테르 상과 하부 수성 상이 분리됩니다. 강글리오사이드가 들어있는 하부 상을 PTFE가 늘어선 캡이있는 유리 병에 넣으십시오. 분리 깔때기에 남아있는 상부 에테르 상에 이전 단계의 원래 상청액 밀리리터 당 0.1 밀리리터의 물을 첨가하십시오.
격렬하게 흔들어 주십시오. 위상을 분리하도록 허용합니다. 그런 다음 더 낮은 수성 상을 수집하고, 이전에 수집 된 하부 상과 결합하십시오.
결합 된 하부 상을 건조 분말로 증발시키고 무게를 측정하십시오. 역상 크로마토그래피를 수행하기 위해, 세척당 1분 미만 동안 진공 또는 압력을 사용하여 컬럼을 통해 50밀리리터의 용매를 통과시켜 대규모 tC18 고체상 추출 카트리지를 사전 세척한다. 비누화 후 상 분리로부터 상부 상을 진공 또는 압력에 의해 컬럼 상에 로딩한다.
그런 다음 플로우 스루를 수집하고, 다시 로드하고, 후속 분석을 위해 플로우 스루를 다시 수집합니다. 컬럼을 각각 30 밀리리터의 클로로포름-메탄올-물로 세척하고, 이어서 메탄올-물로 세척한다. 그런 다음 50 밀리리터의 메탄올로 강글리오사이드를 용출시킨 다음 다시 10 밀리리터의 메탄올로 용출시킨다.
각 세척과 용출을 개별적으로 수집하십시오. 박층 크로마토그래피 또는 TLC를 사용하여 강글리오사이드가 유동 관통으로부터 부재하고 메탄올의 첫 번째 용출에서 세척 및 용출되는 것을 확인한다. 용출 된 신경절을 건조한 분말로 증발시키고 무게를 측정하십시오.
TLC를 수행하기 위해 실행 용제를 스테인리스 스틸 커버가있는 10 x 10 센티미터의 유리 TLC 챔버에 부어 용매 깊이가 0.5 센티미터가되도록하십시오. 챔버를 덮고 약 10 분 동안 평형을 이루도록하십시오. 메탄올을 사용하여 경사 바늘로 10 마이크로리터 해밀턴 주사기를 세척하십시오.
한 마이크로 리터의 메탄올을 유리 주사기에 그려 바늘 죽은 부피를 채운 다음 한 마이크로 리터의 샘플 또는 표준을 채 웁니다. 샘플을 다섯 밀리미터, 미리 표시된 라인 상에 고르게 스팟하여 한 마이크로리터 미만의 메탄올 용매가 주사기에 남아있을 때까지 한다. 모든 샘플이 발견 된 후 플레이트를 섭씨 22도에서 건조시킵니다.
스팟팅되고 건조된 플레이트를 실행 용매에 침지된 바닥 에지가 있는 미리 평형화된 TLC 챔버 상에 놓는다. 용매 전면이 플레이트 상단의 한 센티미터 내에 도달 할 때까지 실행 용매가 모세관 작용에 의해 플레이트를 전진 시키도록하십시오. 플레이트 가장자리의 솔벤트 앞면을 제거하고 연필로 표시하십시오.
용매가 방해받지 않거나 온화한 공기 흐름 하에서 완전히 증발하도록하십시오. 화학 흄 후드에서 분해 된 강글리오사이드 원산지가있는 TLC 플레이트를 거꾸로 뒤집어 놓아 후드의 벽을 산 스프레이로부터 보호하십시오. 레조르시놀 스프레이 시약을 유리 TLC 분무기에 넣으십시오.
가압 된 질소 공급원에 부착하고 수직 및 수평 방향으로 대각선으로 플레이트를 가볍게 분무하십시오. 동일한 치수의 깨끗하고 건조한 유리 커버 플레이트로 플레이트를 즉시 덮고 커버 플레이트를 바인더 클립으로 제자리에 고정하십시오. 덮인 플레이트를 섭씨 125도에서 20 분 동안 가열하십시오.
Ganglioside는 흰색 배경에 대해 진한 보라색으로 나타납니다. 지질 염색을 수행하기 위해, TLC 플레이트를 리졸린 강글리오시드 기원 측면 아래로 내려 아니스알데히드 염색을 함유하는 비이커에 담그십시오. 두 초 이상 달리기 전면에 잠기십시오.
그런 다음 배수하십시오. TLC 플레이트를 저온에서 핫 플레이트에 가열하여 발전시킵니다. 이 프로토콜은 질적 및 양적 결정을 위해 충분한 양과 순도로 강글리오사이드를 제공합니다.
하나의 마이크로리터의 TLC 분해능은 레조르시놀 검출을 위한 충분한 물질을 제공하고 야생형 및 유전자 변형 마우스에 대한 모든 주요 뇌 신경절을 해결한다. 제조된 혼합 강글리오시드가 다른 주요 지질을 함유하지 않더라도, 이들은 음성 모드에서 천연 정제된 강글리오시드로서 또는 양성 모드에서 예비메틸화 후 질량 분광학적 결정을 위해 충분한 순도를 갖는다. 대규모 정제는 생물학적 실험 및 추가의 화학적 및 효소적 변형에 적합한 정제된 주요 뇌 강글리오시드를 제공하기 위해 추출, 비누화 및 HPLC 분해능을 포함한다.
예시적인 HPLC 프로파일 및 후속 TLC 분석이 도시되어 있다. 알칼리 처리 또는 비누화는 오염 된 인지질을 가수분해하고 제거하는 데 필요하지만 일부 상황에서 중요 할 수있는 O- 아세틸화 시알산과 같은 강글리오시드의 자연 변형을 가수분해합니다. 추출, 용매 분배 및 TLC 분해능을 위한 정확한 용매 비율은 회수, 순도 및 분석을 향상시키는 데 매우 중요합니다.
암에서 신진 대사, 뇌 기능에 이르기까지 강글리오사이드는 생리적 개질제 및 치료 대상입니다. Ganglioside 격리, 정화 및 분석은 생물 의학 발견 및 치료 개발을위한 초석입니다.
