Это видео показывает индукцию in vitro стволовых клеток пульпы зубов человека к линиям поджелудочной железы. Стволовые клетки дают альтернативное лечение при многих заболеваниях, включая диабет типа I, которые вызывают биолагию бета-клеток. Трансплантация инсулин-продуцирующих клеток станет новым перспективным методом для возникновения пожизненного.
В этом видео описаны два подхода к генерации инсулин-продуцирующих клеток, включая интегративный и неинтетивный протокол индукции. И в этой части объясняется интеграционный протокол индуцирования инсулин-продуцирующих клеток из стволовых клеток пульпы зубов человека. Для индукционного протокола это для смешивания естественного процесса развития поджелудочной железы.
Получить естественные и функциональные инсулин-продуцирующие клетки. Для генерации инсулин-продуцирующих клеток из мезенхимальных стволовых клеток, таких как стволовые клетки пульпы зубов, используется протокол многоступенчатой индукции. Мезенхимальные стволовые клетки используются в слове окончательная эндодерма, эндодерма поджелудочной железы, эндокринная железа, а затем бета-клетки поджелудочной железы или инсулин-продуцирующие клетки соответственно.
Чтобы индуцировать клетки, трехступенчатый индукционный подход используется в качестве основного протокола. Интегративный протокол использовал чрезмерное истечение срока действия основного фактора транскрипции поджелудочной железы, PDX-1, стволовыми клетками пульпы зубов человека. Затем PDX-1 сверхэкспрессированные стволовые клетки будут дополнительно индуцированы с использованием трехступенчатого протокола дифференцировки.
Потенциал дифференцировки поджелудочной железы с помощью интегративного протокола будет сравниваться с неинтертетивным протоколом, как показано в анимации. Эта идея была выполнена в соответствии с утвержденным протоколом Комитетом по этике исследований человека, факультет стоматологии Университета Чулалонгкорн с информированного согласия пациентов. Этот протокол начался с истечения срока действия PDX-1.
Для трансдукции используются стволовые клетки пульпы зубов человека в частях от 2 до 5, со слиянием 70-80%. Клетки трипсинизируются и подсчитываются. Затем один миллион клеток помещается на трансфекционный сосуд и инкубируется в течение ночи.
Через 24 часа свежеприготовленный антивирус, несущий ген PDX-1, добавляют в культивированный сосуд в соответствии с желаемой множественностью инфекции. Затем трансфекированные клетки хранят в инкубаторе в течение 24 часов. Затем свежую культивируемую среду меняют и выдерживая еще 48 периодов.
Морфология трансфефицированных клеток проверяется перед использованием для дальнейшей индукционной ступени. Стволовые клетки пульпы зубов человека с PDX-1 по истечении срока годности затем триптимизируются и суспендируются в первой индукционной среде поджелудочной железы, так называемой среде A.In этом этапе используется культивируемый сосуд с низким прикреплением. Морфология PDX-1 над выраженными стволовыми клетками пульпы зубов человека на 3-й день после индукции среды А.
Клетки с хорошей морфологией будут затем использованы для дальнейшей индукции. На следующем этапе вторая индукционная среда, так называемая среда B, добавляется к культивированной емкости. Наблюдается морфология PDX-1 над выраженными стволовыми клетками пульпы зубов человека на второй день после индукции среды.
Клетки с хорошей морфологией будут затем использоваться для дальнейшей индукционной ступени. На следующем этапе к культивированной емкости добавляют третью индукционную среду, так называемую среду С. Через 5 дней наблюдается морфология клеток.
Клеточные колонии собираются для дальнейшего анализа. Включая морфологию и размер колонии, экспрессию маркера гена поджелудочной железы и функциональное свойство в отношении глюкозо-стимулируемой секреции С-пептида или анализа GSCS. Для неинтективного индукционного подхода используется трехступенчатый индукционный протокол, упомянутый ранее.
Один миллион клеток повторно суспензируют в среде А и сидят на сосуде культуры с низким прикреплением. Затем культивировали в течение трех дней. После проверки морфологии серия индукционных сред, включая среду B и C, впоследствии добавляется к культивированной сосуду на третий и пятый день соответственно.
На 10 день наблюдается морфология клеток. Клеточные колонии собираются для дальнейшего анализа, включая морфологию и размер колонии, экспрессию маркера гена поджелудочной железы и функциональные свойства в отношении секреции С-пептида, стимулируемой глюкозой, или анализа GSCS. Результаты обоих протоколов индукции сравниваются в обоих протоколах.
Стволовые клетки пульпы зубов человека способны образовывать колониеобразную структуру с самого первого дня индукции. Внешний вид колоний круглый и плотный. Все колонии плавают в сосудах культуры на протяжении всего индукционного периода.
Общее количество колоний интегративного протокола индукции немного выше, чем в неинтективной индукции. Эволюция в процентном соотношении колонии показывает благотворную тенденцию, от формирования колонии малого до среднего размера после интегративной индукции, что важно для уменьшения некротического ядра внутри колонии. Анализ маркеров генов поджелудочной железы показал, что интегративный индуктивный протокол дает колонии с высоким истечением срока действия маркеров поджелудочной железы, включая MAP-A, GLUT-2, инсулин и GLP-1R, предполагая дифференцировку в сторону измеренных инсулин-продуцирующих клеток.
Для функции глюкозы важна секреция С-пептида. Результаты показывают, что оба протокола индукции дают колонии с хорошим ответом на вызов глюкозы. Из этого исследования оба протокола индукции поджелудочной железы способны генерировать инсулин-продуцирующие клетки in vitro с точки зрения истечения срока действия маркера поджелудочной железы и функционального свойства, протоколы показывают лучшее качество образования инсулин-продуцирующих клеток.
Предположение о тенденциях применения мезенхимальных стволовых клеток человека, таких как стволовые клетки пульпы человека, в лечении диабета на основе стволовых клеток в ближайшем будущем.
