Bu video, insan diş hamuru kök hücrelerinin pankreas soylarına doğru in vitro indüksiyonunu gösteriyor. Kök hücreler, beta hücrelerinin biyolagingine neden olan diyabet tipi I de dahil olmak üzere birçok hastalıkta alternatif bir tedavi verir. İnsülin üreten hücrelerin nakli, yaşam boyu neden olmak için yeni umut verici yöntem olacaktır.
Bu videoda, bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolü de dahil olmak üzere insülin üreten hücre üretmek için iki yaklaşım açıklanmıştır. Ve bu bölümde, insülin üreten hücrelerin insan diş hamuru kök hücresinden indüklenerek entegrasyon protokolü açıklanmıştır. İndüksiyon protokolü için doğal pankreas gelişim sürecini karıştırmak içindir.
Doğal ve fonksiyonel insülin üreten hücreleri elde etmek. Diş pulpası kök hücreleri gibi mezenkimal kök hücrelerden insülin üreten hücreler üretmek için çok adımlı indüksiyon protokolü kullanılır. Mezenkimal kök hücreler sırasıyla kesin endoderm, pankreas endodermi, pankreas endokrin ve daha sonra pankreas beta hücre veya insülin üreten hücreler kelimelerinde kullanılır.
Hücreleri indüklamak için omurga protokolü olarak üç adımlı indüksiyon yaklaşımı kullanılır. Bütünleştirici protokol, temel pankreas transkripsiyon faktörü PDX-1'in insan diş hamuru kök hücreleri tarafından fazla süresinin dolmasını sağladı. Daha sonra ifade edilen kök hücreler üzerinden PDX-1, üç adımlı farklılaşma protokolü kullanılarak daha da indüklenecektir.
Pankreas farklılaşma potansiyeli, bütünleştirici protokol tarafından, animasyonda gösterildiği gibi bütünleştirici olmayan protokolle karşılaştırılacaktır. Bu fikir, Chulalongkorn Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi İnsan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanan protokol kapsamında hastaların bilgilendirilmiş rızası ile gerçeklendirilmiştir. Bu protokol PDX-1'in süresinin dolmasıyla başladı.
Transdüksiyon için %70-80 izdiham ile 2 ila 5 arasında parçalarda insan diş hamuru kök hücreleri kullanılır. Hücreler deneniyor ve sayılıyor. Daha sonra bir milyon hücre transfection damarına oturtılır ve bir gecede kuluçkaya yatırılır.
24 saat sonra pdx-1 geni taşıyan yeni hazırlanmış antivirüs, istenen enfeksiyon çokluğuna göre kültürlü damara eklenir. Transfected hücreler daha sonra 24 saat boyunca inkübatörde tutulur. Daha sonra taze kültürlü ortam değiştirilir ve 48 dönem daha korunur.
Transfected hücrelerin morfolojisi, daha fazla indüksiyon adımı için kullanmadan önce kontrol edilir. Son kullanma tarihi pdx-1 ile insan diş hamuru kök hücreleri daha sonra tryptteed ve ilk pankreas indüksiyon ortamında askıya alınır, bu adım A.In orta denir, düşük bağlanma kültürlü damar kullanılır. Orta A indüksiyonu gözlendikten sonra 3. günde PDX-1'in eksprese edilen insan diş hamuru kök hücreleri üzerinde morfolojisi.
İyi morfolojiye sahip hücreler daha sonra daha fazla indüksiyon adımı için kullanılacaktır. Bir sonraki adımda, orta B olarak adlandırılan ikinci indüksiyon ortamı kültürlü gemiye eklenir. PDX-1'in orta indüksiyondan sonra ikinci günde ifade edilen insan diş pulpası kök hücrelerinin morfolojisi gözlenir.
daha sonra daha fazla indüksiyon adımı için iyi morfolojiye sahip hücreler kullanılacaktır. Bir sonraki adım, orta C olarak adlandırılan üçüncü indüksiyon ortamı kültürlü kap içine eklenir. 5 gün sonra hücre morfolojisi gözlenir.
Hücre kolonileri daha fazla analiz için toplanır. Koloni morfolojisi ve büyüklüğü, pankreas gen belirteci ekspresyonu ve Glikoz uyarılmış C-peptit salgılanması veya GSCS tahlil ile ilgili fonksiyonel özellik dahil. Bütünleştirici olmayan indüksiyon yaklaşımı için daha önce bahsedilen üç aşamalı indüksiyon protokolü örüldüklenmiştir.
Bir milyon hücre A ortamında yeniden askıya alınır ve düşük bağlanma kültür gemisine oturtulur. Sonra üç gün kültürlü oldu. Morfoloji kontrol edildikten sonra, orta B ve C dahil olmak üzere indüksiyon ortamı serisi, daha sonra sırasıyla üçüncü ve beşinci günde kültürlü damara eklenir.
10. günde hücre morfolojisi gözlenir. Hücre kolonileri, koloni morfolojisi ve büyüklüğü, pankreas gen belirteci ekspresyonu ve Glikoz uyarılmış C-peptit salgılanması veya GSCS tahliline ilişkin fonksiyonel özellik de dahil olmak üzere daha fazla analiz için toplanır. Her iki indüksiyon protokolünün sonuçları her iki protokolde de karşılaştırılır.
İnsan diş hamuru kök hücreleri, indüksiyonun ilk gününden itibaren yapı gibi koloni oluşturabilir. Kolonilerin görünümü yuvarlak ve yoğundur. Tüm koloniler indüksiyon süresi boyunca kültür damarlarında yüzüyor.
Bütünleştirici indüksiyon protokolünün toplam koloni sayısı, bütünleştirici olmayan indüksiyondan biraz daha yüksektir. Koloni boyutu yüzdesi altındaki evrim, koloni içindeki nekrotik çekirdeği azaltmak için önemli olan bütünleştirici indüksiyon üzerine küçükten orta büyüklüğe kadar yararlı bir eğilim göstermektedir. Pankreas gen belirteci analizi, bütünleştirici endüktif protokolün MAP-A, GLUT-2, insülin ve GLP-1R dahil olmak üzere pankreas belirteçlerinin yüksek süre sonu olan kolonileri sağladığını ve ölçülen insülin üreten hücrelere doğru farklılaşmayı önerdiğini ortaya koydu.
Fonksiyon için glikoz C-peptit salgılanması önemlidir. Sonuçlar, her iki indüksiyon protokolünün de kolonilere glikoz zorluğuna iyi yanıt verdiğini göstermektedir. Bu çalışmadan, pankreas indüksiyon protokollerinin her ikisi de pankreas belirtecinin sona ermesi ve fonksiyonel özelliği açısından insülin üreten hücreleri in vitro olarak üretebilmektedir, protokoller insülin üreten hücre oluşumunun daha kaliteli olduğunu göstermektedir.
Kök hücre bazlı diyabet tedavisinde insan diş hamuru kök hücre uygulaması gibi insan mezenkimal kök hücrelerinin eğilimlerini yakın gelecekte önermektedir.
