Questo video mostra l'induzione in vitro di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici. Le cellule staminali danno un trattamento alternativo in molte malattie tra cui il diabete di tipo I che causano il biolaging delle cellule beta. Il trapianto di cellule produttrici di insulina sarà il nuovo metodo promettente per causare la vita.
In questo video vengono descritti due approcci per la generazione di cellule produttrici di insulina, incluso il protocollo di induzione integrativa e non integrativa. E in questa parte viene spiegato il protocollo di integrazione per indurre cellule produttrici di insulina da cellule staminali della polpa dentale umana. Per il protocollo di induzione è il per mescolare il naturale processo di sviluppo pancreatico.
Per ottenere le cellule produttrici di insulina naturale e funzionale. Per generare cellule produttrici di insulina da cellule staminali mesenchimali come le cellule staminali della polpa dentale, viene utilizzato il protocollo di induzione a più fasi. Le cellule staminali mesenchimali sono utilizzate rispettivamente nella parola endoderma definitivo, endoderma pancreatico, endocrino pancreatico e poi cellule beta pancreatiche o cellule produttrici di insulina.
Per indurre le cellule, l'approccio di induzione in tre fasi viene utilizzato come protocollo backbone. Il protocollo integrativo impiegava la sovraespirazione del fattore di trascrizione pancreatico essenziale, PDX-1, da parte delle cellule staminali della polpa dentale umana. Quindi il PDX-1 sulle cellule staminali espresse sarà ulteriormente indotto utilizzando il protocollo di differenziazione in tre fasi.
Il potenziale di differenziazione pancreatica, tramite il protocollo integrativo, sarà confrontato con il protocollo non integrativo come illustrato nell'animazione. Questa idea è stata eseguita secondo il protocollo approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana, Facoltà di Odontoiatria, Università Chulalongkorn con il consenso informato dei pazienti. Questo protocollo è iniziato con la scadenza eccessiva di PDX-1.
Le cellule staminali della polpa dentale umana in parti da 2 a 5, con confluenza del 70-80%, vengono utilizzate per la trasduzione. Le cellule vengono tripsinite e contate. Quindi un milione di cellule sono sedute sul vaso di trasfezione e incubate durante la notte.
24 ore dopo, l'antivirus appena preparato che trasporta il gene PDX-1 viene aggiunto alla nave coltivata in base alla molteplicità desiderata di infezione. Le cellule trasfettate vengono quindi conservate nell'incubatrice per 24 ore. Quindi il terreno coltivato fresco viene cambiato e mantenuto per un altro periodo di 48.
La morfologia delle cellule trasfettate viene controllata prima dell'uso per un'ulteriore fase di induzione. Le cellule staminali della polpa dentale umana con PDX-1 oltre la scadenza vengono quindi tryptimizzate e sospese nel primo mezzo di induzione pancreatica, il cosiddetto mezzo A.In questo passaggio, viene utilizzato un vaso coltivato a basso attaccamento. Morfologia della PDX-1 su cellule staminali della polpa dentale umana espresse il giorno 3 dopo l'induzione del mezzo A.
Le cellule con una buona morfologia saranno quindi utilizzate per ulteriori fasi di induzione. Il passo successivo, il secondo mezzo di induzione, il cosiddetto mezzo B, viene aggiunto alla nave coltivata. Si osserva la morfologia di PDX-1 sulle cellule staminali della polpa dentale umana espresse il secondo giorno dopo l'induzione del mezzo.
Le cellule con una buona morfologia saranno quindi utilizzate per un'ulteriore fase di induzione. Il passo successivo, il terzo mezzo di induzione, il cosiddetto mezzo C, viene aggiunto al vaso coltivato. 5 giorni dopo si osserva la morfologia cellulare.
Le colonie cellulari vengono raccolte per ulteriori analisi. Compresa la morfologia e le dimensioni della colonia, l'espressione del marcatore genico pancreatico e le proprietà funzionali relative alla secrezione di peptide C stimolata dal glucosio o al test GSCS. Per l'approccio di induzione non integrativa, viene utilizzato il protocollo di induzione in tre fasi menzionato in precedenza.
Un milione di cellule vengono ri-sospese nel mezzo A e sedute su un recipiente di coltura a basso attacco. Poi coltivato per tre giorni. Dopo il controllo della morfologia, serie di mezzi di induzione, tra cui il mezzo B e C, vengono successivamente aggiunti al vaso coltivato rispettivamente il terzo e il quinto giorno.
Al giorno 10 si osserva la morfologia cellulare. Le colonie cellulari vengono raccolte per ulteriori analisi, tra cui la morfologia e le dimensioni delle colonie, l'espressione del marcatore genico pancreatico e le proprietà funzionali relative alla secrezione di peptide C stimolata dal glucosio o al test GSCS. I risultati di entrambi i protocolli di induzione sono confrontati in entrambi i protocolli.
Le cellule staminali della polpa dentale umana sono in grado di formare una struttura simile a una colonia fin dal primo giorno dell'induzione. L'aspetto delle colonie è rotondo e denso. Tutte le colonie galleggiano nei vasi di coltura per tutto il periodo di induzione.
Il numero totale di colonie del protocollo di induzione integrativa è leggermente superiore a quello dell'induzione non integrativa. L'evoluzione sotto la percentuale di dimensioni della colonia mostra un andamento benefico, dalla formazione di colonie di piccole e medie dimensioni all'induzione integrativa, che è importante per ridurre il nucleo necrotico all'interno della colonia. L'analisi dei marcatori genici pancreatici ha rivelato che il protocollo induttivo integrativo produce colonie con elevata scadenza di marcatori pancreatici, tra cui MAP-A, GLUT-2, insulina e GLP-1R, suggerendo la differenziazione verso le cellule produttrici di insulina misurate.
Per la funzione glucosio C-peptide secrezione è importante. I risultati mostrano che entrambi i protocolli di induzione producono le colonie con una buona risposta alla sfida del glucosio. Da questo studio, entrambi i protocolli di induzione pancreatica sono in grado di generare le cellule produttrici di insulina in vitro in termini di scadenza del marcatore pancreatico e proprietà funzionale, i protocolli mostrano una migliore qualità della formazione cellulare produttrice di insulina.
Suggerendo le tendenze delle cellule staminali mesenchimali umane come l'applicazione di cellule staminali della polpa dentale umana nel trattamento del diabete a base di cellule staminali nel prossimo futuro.
