Este video muestra la inducción in vitro de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos. Las células madre dan un tratamiento alternativo en muchas enfermedades, incluida la diabetes tipo I, que causan la biomallación de las células beta. El trasplante de células productoras de insulina será el nuevo método prometedor para causar vida.
En este video se describen dos enfoques para generar células productoras de insulina, incluyendo el protocolo de inducción integrativa y no integrativa. Y en esta parte se explica el protocolo de integración para inducir células productoras de insulina a partir de células madre de pulpa dental humana. Para el protocolo de inducción es el para mezclar el proceso natural de desarrollo pancreático.
Obtener las células productoras de insulina naturales y funcionales. Para generar células productoras de insulina a partir de células madre mesenquimales como las células madre de la pulpa dental, se emplea el protocolo de inducción de varios pasos. Las células madre mesenquimales se utilizan en la palabra endodermo definitivo, endodermo pancreático, endocrino pancreático y luego células beta pancreáticas o células productoras de insulina respectivamente.
Para inducir las células, se utiliza el enfoque de inducción de tres pasos como protocolo de columna vertebral. El protocolo integrativo empleó la sobreespiración del factor de transcripción pancreático esencial, PDX-1, por las células madre de la pulpa dental humana. Luego, las células madre sobre expresadas PDX-1 se inducirán aún más utilizando el protocolo de diferenciación de tres pasos.
El potencial de diferenciación pancreática, por el protocolo integrativo, se comparará con el protocolo no integrativo como se ilustra en la animación. Esta idea se realizó bajo el protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Humana, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn con el consentimiento informado de los pacientes. Este protocolo comenzó con la caducidad de PDX-1.
Las células madre de la pulpa dental humana en partes de 2 a 5, con 70-80% de confluencia, se utilizan para la transducción. Las células se tripsinizan y se cuentan. Luego, un millón de células se sientan en el recipiente de transfección y se incuban durante la noche.
24 horas después, el antivirus recién preparado que lleva el gen PDX-1 se agrega al vaso cultivado de acuerdo con la multiplicidad de infección deseada. Las células transfectadas se mantienen en la incubadora durante 24 horas. Luego, el medio cultivado fresco se cambia y se mantiene durante otro período de 48.
La morfología de las células transfectadas se comprueba antes de usarlas para una etapa de inducción adicional. Las células madre de la pulpa dental humana con PDX-1 sobre la expiración se triptimizan y se suspenden en el primer medio de inducción pancreática, llamado medio A.In este paso, se utiliza un vaso cultivado de baja unión. Morfología de PDX-1 sobre las células madre de la pulpa dental humana expresadas en el día 3 después de la inducción del Medio A.
Las células con buena morfología se utilizarán para el paso de inducciones posteriores. El siguiente paso, el segundo medio de inducción, llamado medio B, se agrega al vaso cultivado. Se observa la morfología de PDX-1 sobre las células madre de la pulpa dental humana sobre expresadas en el segundo día después de la inducción media.
Las células con buena morfología se utilizarán para un paso de inducción adicional. El siguiente paso, el tercer medio de inducción, llamado medio C, se agrega al vaso cultivado. 5 días después se observa la morfología celular.
Las colonias celulares se recogen para su posterior análisis. Incluyendo la morfología y el tamaño de la colonia, la expresión de marcadores genéticos pancreáticos y la propiedad funcional con respecto a la secreción de péptido C estimulado por glucosa o el ensayo GSCS. Para el enfoque de inducción no integrativa, se emplea el protocolo de inducción de tres pasos mencionado anteriormente.
Un millón de células se vuelven a suspender en el medio A y se asentan en un recipiente de cultivo de baja fijación. Luego cultivado durante tres días. Después de que se verifica la morfología, las series de medios de inducción, incluidos los medios B y C, se agregan posteriormente al vaso cultivado en el día tres y cinco, respectivamente.
En el día 10, se observa la morfología celular. Las colonias celulares se recolectan para su posterior análisis, incluida la morfología y el tamaño de la colonia, la expresión de marcadores genéticos pancreáticos y la propiedad funcional con respecto a la secreción de péptido C estimulado por glucosa o el ensayo GSCS. Los resultados de ambos protocolos de inducción se comparan en ambos protocolos.
Las células madre de la pulpa dental humana son capaces de formar una estructura similar a una colonia desde el primer día de la inducción. La apariencia de las colonias es redonda y densa. Todas las colonias están flotando en los recipientes de cultivo durante todo el período de inducción.
El recuento total de colonias del protocolo de inducción integrativa es un poco mayor que el de la inducción no integrativa. La evolución bajo el porcentaje de tamaño de colonia muestra una tendencia beneficiosa, de formación de colonias pequeñas a medianas tras la inducción integradora, que es importante para reducir el núcleo necrótico dentro de la colonia. El análisis de marcadores genéticos pancreáticos reveló que el protocolo inductivo integrador produce las colonias con alta expiración de marcadores pancreáticos, incluidos MAP-A, GLUT-2, insulina y GLP-1R, lo que sugiere la diferenciación hacia las células productoras de insulina medidas.
Para la función glucosa la secreción del péptido C es importante. Los resultados muestran que ambos protocolos de inducción rinden las colonias con buena respuesta al desafío de la glucosa. A partir de este estudio, ambos protocolos de inducción pancreática son capaces de generar las células productoras de insulina in vitro en términos de espiración del marcador pancreático y propiedad funcional, los protocolos muestran una mejor calidad de la formación de células productoras de insulina.
Sugiriendo las tendencias de las células madre mesenquimales humanas como la aplicación de células madre de pulpa dental humana en el tratamiento de la diabetes basada en células madre en un futuro próximo.
