С около 100 миллионами клеток в мозге мыши и размерами изображений клеточного разрешения всего мозга, приближающихся к терабайтной шкале, для точной количественной оценки клеток необходимы передовые инструменты анализа изображений. Наш вычислительный конвейер может предварительно обрабатывать изображения и количественно оценивать ядра в коре головного мозга мыши, сохраняя при этом разумный компромисс между точностью обнаружения клеток, временем визуализации и вычислительными ресурсами. Демонстрировать процедуру будут Феликс Кайер и Ян Кертин, аспиранты из моей лаборатории.
Для начала установите образец в держатель правильного размера образца таким образом, чтобы образец был ориентирован с z-размерностью не более 5,2 миллиметра в глубину из-за номинального рабочего расстояния микроскопа UltraMicroscope II. Затем вставьте держатель в колыбель образца таким образом, чтобы винт держателя находился под углом 45 градусов к опорам люльки. Затем поместите люльку в такое положение, чтобы образец был ориентирован перпендикулярно световому пути.
После этого установите масштаб на микроскопе на 4-кратное увеличение или выше, что дает 0,75 микрометра на пиксель. В программном обеспечении Inspector Pro выберите один световой лист с числовым значением диафрагмы приблизительно 0,08. Чтобы обеспечить поддержание осевого разрешения по ширине изображения, выберите «Горизонтальная динамическая фокусировка» и примените рекомендуемое количество шагов в зависимости от длины волны лазера.
Затем отрегулируйте тонкую фокусировку для каждого канала по отношению к каналу регистрации и мощность лазера на канал по отношению к свойствам канала. Затем отрегулируйте ширину светового листа примерно до 50%, чтобы обеспечить оптимальное распределение мощности листа в измерении Y для размера образца. После этого установите количество плиток по отношению к размеру образца с рекомендуемым перекрытием 15% между плитками и захватите изображения для каждого канала последовательно для каждого стека в заданном положении плитки.
Сначала загрузите и установите диспетчер среды Conda для Linux и инструментов обработки изображений NuMorph. В командной строке запустите matlab и NM_setup. m от NuMorph для загрузки и установки пакетов программного обеспечения для анализа изображений, необходимых для анализа.
Затем укажите имена образцов, входные и выходные каталоги, информацию о каналах и параметры изображения светового листа, отредактировав файл NM_samples.m. Для регулировки интенсивности в NMp_template установите интенсивную настройку на true, а use_processed_images как false при работе с новым набором изображений. Затем установите save_images и save_samples как истинное.
Затем установите базовое затенение плитки, чтобы применить коррекцию затенения с помощью базового алгоритма, или вручную, чтобы применить коррекцию затенения плитки с помощью измерений из UltraMicroscope II при определенной ширине светового листа. Для выравнивания канала изображения в NMp_template задайте для channel_alignment значение true, а для alignment_method канала — трансляцию или эластичность. Затем установите значение sift_refinement true и значение перекрытия 0,15, чтобы соответствовать перекрытиям плиток во время создания изображения.
Чтобы выполнить шаги предварительной обработки в MATLAB, укажите имя образца и задайте для конфигурации NM_config пример процесса. Затем выполните любой из шагов предварительной обработки, указав NM_process стежка конфигурации, указав этап с использованием интенсивности, выравнивания или сшивания, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. Начните с 3D-изображения Атласа и связанного с ним изображения аннотации, которое присваивает каждый воксель определенной структуре.
Выровняйте изображение Атласа и файл аннотации, чтобы убедиться, что они правильно совпадают в правильной ориентации. После выравнивания обработайте файлы в NuMorph, чтобы указать входные данные, как описано в рукописи, выполнив команду. В NMa_template установите для resample_images значение true и resample_resolution в соответствии с Atlas.
Затем укажите номер канала для ресамплинга с помощью resample_channels. После этого установите для register_images значение true, укажите atlas_file, соответствующий файлу в каталоге Atlas, и установите registration_parameters по умолчанию. Затем установите для save_registered_images значение true.
Для обнаружения ядер, подсчета клеток и классификации установите как count_nuclei, так и classify_cells как истинные. Затем установите для count_method значение 3dunet и min_intensity, чтобы определить минимальный порог интенсивности для обнаруженных объектов. Затем установите classify_method либо порога, который основан на неконтролируемой интенсивности флуоресценции в центроидных положениях, либо SVM, который моделирует контролируемый линейный классификатор опорных векторов машины.
Чтобы выполнить шаги анализа в MATLAB, укажите имя образца и задайте конфигурацию NM_config анализа образца. Затем выполните любой из шагов анализа, указав NM_analyze этап конфигурации, указав этап с помощью ресамплинга, регистрации, подсчета или классификации, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. В NMe_template установите для параметра update значение true и compare_structures_by для любого индекса.
Затем задайте файл шаблона и таблицу структур, которая определяет все возможные структурные индексы и структуры для оценки при указании подсчета ячеек и классификации типов ячеек. Очистка тканей с использованием протокола iDISCO+ и нейронально-слой-специфических маркеров ядер привела к четко определенным клеточным группам нейронов верхнего и нижнего слоя в изокортексе. Подсчет клеток с помощью NuMorph зависел от успешных этапов предварительной обработки, включая регулировку интенсивности, выравнивание каналов и сшивание.
Однако ошибки на этапах предварительной обработки могут привести к неправильному сшиванию, что приведет к неправильному выравниванию и сшиванию и, таким образом, приведет к изображениям с рисунком в фокусе и вне фокуса. Чтобы подсчитать ядра из определенных областей мозга, сшитые изображения будут аннотированы с помощью Atlas, что позволит накладывать аннотации на области мозга. Центроиды ядер были обнаружены с помощью обученной 3D-модели U-Net в NuMorph с около 12 миллионами общих ядер, которые были TO-PRO-3-положительными в изокортексе с примерно 2,6 миллионами мозг-двухположительных и 1,6 миллионами CTIP2-положительных ядер.
Было обнаружено около 3,7 и 2,9 млн TO-PRO-3-положительных суммарных ядер в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа соответственно. Тем не менее, два положительных клетки мозга, обнаруженные в этих двух областях мозга, были незначительными, и только около 1,5 из менее чем одного миллиона CTIP2-положительных клеток были обнаружены в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа. Выполняйте визуальные проверки качества во время приобретения, чтобы добиться хорошей сегментации.
И правильно настроить среду Conda, чтобы гарантировать, что при последующем анализе не возникает ошибок. В дополнение к подсчету клеток, этот конвейер позволяет интегрироваться с другими инструментами сегментации, которые измеряют размер и форму клеток, которые затем можно сравнивать по группам генотипов. С помощью нашего конвейера мы можем определить, как анатомия мозга изменяется при клеточном разрешении, что приводит к идентификации типов клеток и областей мозга, важных для риска заболевания.
