Этот протокол применим к изучению стеатоза печени, а также к печеночному, метаболическому, синтетическому и токсикационному путям в контексте стеатоза. Основными преимуществами этого метода являются его воспроизводимость и короткое время, необходимое для получения результатов. Добавьте к этому тот факт, что он предлагает два уровня стеатоза, легкий и тяжелый.
Стеатоз, индуцированный in vitro, может предоставить доказательства для идентификации потенциальных маркеров для диагностики заболевания, а также терапевтических целей. Этот метод предназначен для применения в результате стеатоза. Тем не менее, он может быть адаптирован к широкому спектру различных клеток, затронутых чрезмерным воздействием липидов, например, во время ожирения и липидемии.
Подготовьте стандарт RPMI 1640. Добавка RPMI 1640 к питательной среде с 10% термоактивированной FBS и 1% раствора пенициллина стрептомицина. Стерилизуйте его с помощью 0,22-микрометровых фильтров и храните добавку при четырех градусах Цельсия.
Для приготовления раствора пальмитата готовят 50-миллимолярный раствор пальмитата в стандартном RPMI 1640, дополненный 1% липидным BSA. Стерилизуйте от пяти до десяти миллилитров стокового раствора с помощью фильтров 0,22 микрометра и храните при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, в течение одного месяца. Для приготовления олеатного бульона готовят 50-миллимолярный раствор олеата в дополненном RPMI 1640.
И стерилизуйте стоковый раствор с помощью фильтров 0,22 микрометра. Хранить его при минус 20 градусах Цельсия, защищая от света до одного месяца. Для приготовления стеатогенной среды из предварительно приготовленных бульонов готовят 100 миллиметров 50-микромолярной смеси одной части пальмитата и двух частей олеата.
Для умеренных уровней налейте 500 микромолярной смесь из одной части пальмитата и двух частей олеата для тяжелых уровней в стандарте RPMI 1640. И стерилизуют с помощью фильтров 0,22 микрометра. Хранить при четырех градусах Цельсия до одной недели.
Альтернативно, для приготовления стоковых растворов с соответствующими жирными кислотами с использованием свободного липидного альбумина растворяют либо пальмитат, либо олеат в двух миллилитрах абсолютного этанола и затем смешивают в конечном объеме стандарта RPMI 1640. Растворяют олеат непосредственно путем хранения в стандартной питательной среде RPMI 1640. Дайте испарить этанол, насиживая на водяной бане при 70 градусах Цельсия и тщательно перемешайте.
Стерилизуйте оба стандартных раствора с помощью фильтров 0,22 микрометра и храните раствор пальмитата при четырех градусах Цельсия. И олеат сток раствора при минус 20 градусах Цельсия. Разместил 0,1 миллиона ячеек Hep G2 на скважину в 24-скважинной пластине.
Добавьте один миллилитр стандарта RPMI 1640. Предварительно инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов, обеспечивая прикрепление клеток. После предварительной культуры откажитесь от стандартной среды RPMI 1640.
И добавьте стеатогенную среду. Откажитесь от супернатанта и добавляйте свежую стеатогенную среду каждые 24 часа. Для проведения оценки жизнеспособности и морфологии отбросьте супернатант и отсоедините клетки от скважины, добавив 500 микролитров 0,05% трипсина ЭДТА.
Инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Соберите повторно суспендированные клетки в микропробирку. И центрифугу в 300 раз больше G.Затем выбросьте супернатант, добавьте 200 микролитров стандартного RPMI 1640 и повторно суспендировать ячейки.
Добавьте 15 микролитров 0,4% раствора трипан синего в свежую микротрубку. Добавьте и перемешайте 15 микролитров предыдущей клеточной суспензии. Подсчитайте окрашенные и неокраженные клетки в гемоцитометре и рассчитайте показатели жизнеспособности и смертности.
Поместите крышку клеточной культуры в каждую скважину в 24-скважинной пластине и посейте семена hep G2 клетками, как описано в текстовой рукописи. После соответствующей инкубации промыть клетки одним миллилитром PBS и выбросить супернатант. Смешайте их с одним миллилитром 4%-го параформальдегида в PBS и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.
Отбросьте избыток параформальдегида и промойте клетки одним миллилитром дистиллированной воды. Затем добавляют один миллилитр 70% изопропанола и инкубируют в течение пяти минут. Откажитесь от избытка изопропанола и добавьте один миллилитр раствора Oil-Red O и инкубировать в течение 30 минут.
Отбросьте лишний раствор Oil-Red O, а затем промойте одним миллилитрами дистиллированной воды. Наблюдайте за клетками под микроскопом при увеличении в 400 раз. Случайным образом выберите и сфотографируйте 10 оптических полей со всей площади скважины.
Повторите визуализацию для каждой скважины. Чтобы оценить процент окрашенной в красный цвет области, откройте программное обеспечение ImageJ и импортируйте необходимые файлы, затем нажмите «Настроить» и, используя инструмент «Порог цвета», определите параметр оттенка для обнаружения красного цвета. Затем отрегулируйте насыщенность и яркость изображения.
Сравните окрашенную площадь с полной площадью оптического поля, используя инструмент «Анализ частиц» и рассчитайте средний процент каждой скважины. Вмещение 0,1 миллиона гепатоцитов на скважину в 24-колодезных пластинах обеспечивает оптимальное слияние. Жизнеспособность постепенно уменьшалась по мере увеличения времени культуры, достигая самого низкого уровня в 60% через четыре дня при тяжелом стеатозе.
Соответственно, смертность была выше в гепатоцитах, культивированных в стеатогенных условиях. И она прогрессивно увеличивалась со временем воздействия липидов. Количество клеток постепенно увеличивалось в результате пролиферации.
Тем не менее, скорость пролиферации была ниже при легком стеатозе через три и четыре дня. Напротив, тяжелый стеатоз был связан с более низкой пролиферацией к 24 часам. Окрашивание клеток Oil-Red O продемонстрировало, по меньшей мере, двукратное увеличение липидных капель в клетках, культивируемых в стеатогенных условиях.
Внутриклеточный жир увеличивался в зависимости от времени воздействия культуры в стеатогенную среду. При легком стеатозе содержание липидов увеличивалось со второго дня, тогда как при тяжелом стеатозе они были значительно высокими, начиная с 24 часов. Клеточная культура требует предварительного опыта.
Культивирование клеток Hep G2 в стандартном состоянии до использования этого протокола может быть полезным. Подготовка жирнокислого запаса также является решающим моментом. Пальмитиновая кислота твердая при комнатной температуре, и ее необходимо нагреть перед ее приемом.
Этот метод должен позволять проводить молекулярный анализ различных путей, включая, но не ограничиваясь, пролиферацией, апоптозом, аутофагией, окислительным стрессом и фармакологическим и токсикологическим анализом.
