Этот метод демонстрирует использование клеток AML-12, которые позволят построить модель и исследовать защитные эффекты платикодина D на НАЖБП. Чрезмерная зависимость от использования животных моделей увеличивает бремя разработки терапевтических лекарств. Использование клеточных моделей на ранней стадии разработки лекарств от НАЖБП является более практичным и экономически эффективным.
Эта модель ТКМ может помочь улучшить понимание биологической функции платикодина D и помочь изучить использование других ТКМ для лечения НАЖБП. Начните с посева одного миллилитра клеток AML-12 в лунку в 12-луночные планшеты. Затем разделите 12-луночную пластину на четыре разные группы лечения и обозначьте их как контрольную, обработанную БП, обработанную ПА и группу ПА плюс БП.
Добавьте один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток на лунку в контрольную группу и группу с БП. Добавьте один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток с добавлением 300 микромолярной пальмитиновой кислоты в группу, обработанную ПА, и ПА плюс БП. После 24 часов инкубации удалите питательную среду из клеток, а затем промойте клетки одним миллилитром среды, не содержащей сыворотки, два раза.
Затем добавьте один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток, дополненной носителем, в контрольную группу и один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток, дополненную одним микромолярным платикодином D, в группу обработанной БП. Добавьте один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток, дополненной 300 микромолярной пальмитиновой кислотой, в группу, обработанную ПА, и один миллилитр нормальной среды для культивирования клеток, дополненную 300 микромолярной пальмитиновой кислотой и одним микромолярным платикодином D, в группу, обработанную ПА плюс БП. После обработки клеток в течение 24 часов промойте клетки одним миллилитром 1X PBS на лунку три раза.
Затем окрашивают клетки 100 микролитрами 10 микромолярных DCFH-DA на лунку. Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 минут. После инкубации промойте ячейки 1X PBS три раза и добавьте по одному миллилитру 1X PBS в каждую лунку.
Поместите 12-луночную пластину на столик микроскопа и используйте 20-кратный объектив для наблюдения за морфологией клеток при 200-кратном увеличении. Чтобы измерить потенциал митохондриальной мембраны, промойте обработанные клетки, подготовленные ранее, одним миллилитром 1X PBS на лунку три раза. Затем окрашивают клетки рабочим раствором JC-1 объемом 100 микролитров по пять микрограммов на миллилитр и инкубируют клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте.
Затем промойте ячейки 1X PBS три раза и добавьте по одному миллилитру 1X PBS в каждую лунку. Поместите 12-луночную пластину на столик микроскопа и используйте 20-кратный объектив для наблюдения за морфологией клеток при 200-кратном увеличении. Лизируйте обработанные клетки и соберите клеточный лизат в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра.
Центрифугируйте пробирки при 12 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем добавьте 5X SDS-PAGE буфер загрузки образца в надосадочную жидкость клеточного лизата с соотношением объема один к четырем. Затем поместите подготовленный 12%-ный гель SDS-PAGE с 12 лунками в резервуар для электрофореза и добавьте 1X буфер для образцов SDS, разбавленный сверхчистой водой, до рекомендуемого предела высоты.
После электрофореза SDS-PAGE проводят электроперенос белков на 0,45-микронную мембрану PVDF. Инкубируют мембрану в пяти миллилитрах первичных антител, разведенных в блокирующем буфере. Используйте антитела, специфичные для LC-III, p62 и бета-актина.
Инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем инкубируйте мембрану PVDF с вторичным антителом кролика против мыши LGG HRP, разбавленным от одного до 10 000 в блокирующем буфере. Инкубируют мембрану при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение двух часов.
После инкубации поместите мембрану PVDF на пищевую пленку. Добавьте необходимое количество рабочего раствора ECL и выдерживайте в течение двух минут. Затем удалите рабочий раствор ECL и обнажьте мембрану PVDF в системе визуализации для проявления изображения.
Окрашивание DCFH-DA показало, что платикодин D может значительно снизить уровень внутриклеточных АФК в клетках ALM-12, что указывает на то, что эта обработка может снизить клеточный окислительный стресс. Кроме того, зеленая флуоресценция, представляющая мономеры JC-1 или деполяризованные митохондрии, была выше в клетках, обработанных пальмитиновой кислотой, чем в необработанных клетках, тогда как красная флуоресценция, представляющая димеры JC-1 или поляризованные митохондрии, была ниже в клетках, обработанных пальмитиновой кислотой, чем в необработанных клетках, что указывает на деполяризацию MMP, индуцированную пальмитиновой кислотой. Кроме того, по сравнению с модельной группой, отношение мономеров JC-1 к димерам снизилось в группе лечения платикодином D, что указывает на то, что он может улучшить ММР, индуцированный пальмитиновой кислотой.
Уровни экспрессии белков LC-III и p62, связанных с аутофагией, исследовали методом вестерн-блоттинга. Соотношение LC-32 и LC-31 значительно снижалось, а уровень экспрессии белка p62 увеличивался после лечения пальмитиновой кислотой. С другой стороны, платикодин D значительно снижал уровень экспрессии белка р62 и увеличивал отношение LC-32 к LC-31, что указывает на восстановление аутофагического потока, индуцированного пальмитиновой кислотой.
Если значение флуоресценции клеток в отрицательной контрольной группе относительно высокое, рабочие концентрации флуоресцентных зондов могут быть скорректированы по мере необходимости.
