В видео мы представляем протокол замораживания-разрыва внеклеточных везикул, происходящих из раковых клеток мочевого пузыря in vitro. Внеклеточные везикулы представляют собой мембранно-ограниченные везикулы, которые, полученные из клеток, высвобождаются во внеклеточное пространство и играют роль в межклеточной связи. Внутри внеклеточных везикул мы дискриминируем три популяции: экзосомы, микровезикулы и апоптотические тела, которые различаются по происхождению, размеру и молекулярному составу.
Молекулярный состав внеклеточных везикул отражает молекулярный профиль донорской клетки и препятствует биологическим процессам в клетке-реципиенте. Однако состав ограничивающей мембраны клеточных везикул имеет решающее значение для взаимодействия с клеточной мембраной реципиента. Чтобы проанализировать организацию ограничивающей мембраны, внеклеточные везикулы должны быть сначала выделены, а затем приближены к технике замораживания-перелома.
Freeze-fracture — электронно-микроскопическая методика, посвященная изучению двумерной организации биологических мембран, включая везикулы. Этапы замораживания-разрыва представляют собой быстрое замораживание образца, разрыв образца, создание копии замороженной трещины поверхности и очистку копии для удаления биологических материалов. Реплики, наконец, визуализируются с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
Наша цель состояла в том, чтобы использовать технику замораживания-разрушения для характеристики микровезикул с точки зрения формы, размера и состава мембраны. Начните с выращивания клеток в клеточном инкубаторе. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их изменчивость и слияние.
Собирают питательные среды с микровезикулами в пробирки и центрифугируют при 300 г-силах в течение 10 минут. Собирайте супернатант. Впоследствии центрифуга супернатант с 2000 g-силами и 10 000 g-силами.
После этого понаблюдайте за кончиком трубки на предмет беловатой гранулы, указывающей на микровезикулы. Осторожно удалите супернатант. Добавьте 1,5 миллилитра PBS и повторно суспендируйте гранулы, содержащие микровезикулы.
Затем центрифуга при 10 000 g-силах. Следите за беловатыми гранулами. Удалите супернатант и аккуратно добавьте фиксирующее средство.
Оставьте на 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Затем снимите фиксатор и добавьте буфер для стирки, чтобы промыть гранулу, не подвешивая ее повторно. Оставьте на 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
Удалите буфер для промывки и добавьте 30% глицерина в гранулы. Повторно суспендировать гранулы в однородную суспензию и инкубировать в течение 30 минут при температуре 4 градусов Цельсия. Подготовьте чистые медные носители с центральной ямкой и разработайте колбу с нахмуренным и жидким азотом.
Под микроскопом перенесите образец в центральную яму медного носителя. Смешайте затвердевший фреон, чтобы он стал разжиженным. Захватите пинцетом наружное кольцо носителя и погрузите его в охлажденный фреон.
Через восемь секунд быстро переложите носитель в развивающуюся колбу с жидким азотом. Марк крио мерзкий и охлаждает его. Под жидким азотом соберите носители в мерзкий, закройте его и храните в контейнере с жидким азотом до замерзания ГРП.
Подготовьте морозильную фракционную установку в соответствии с инструкцией по эксплуатации производителя. Запустите вакуумную систему и охладите камеру агрегата до минус 150 градусов цельсия. Перенесите медные носители с замороженным образцом в морозильно-фракционную установку.
Установите температуру ножа до минус 100 градусов по Цельсию и дождитесь вакуума. Начните секционирование образца, включив моторизованное движение ножа до тех пор, пока поверхность образца не станет гладкой. Для разрыва пласта отключите моторизованное движение ножа и приступайте к медленному ручному управлению ножом.
Продолжайте затенение платины под углом 45 градусов. Включите высокое напряжение и увеличьте ток к платиновому пистолету. Искры платины должны начать затенять образец.
Контролируйте положение платины на мониторе толщины кристаллов кварца. Рекомендуемая толщина платины составляет 2,5 нанометра. Выключите ток и высокое напряжение.
Продолжайте углеродное затенение под углом 90 градусов. Включите высокое напряжение и увеличьте ток к углеродному пистолету. Искры углерода должны начать затенять образец.
Когда будет получено 2,5 нанометра углерода, выключите ток и высокое напряжение. Перенесите эти образцы с репликами из блока замораживания-разрушения на 12-клапанную пластину, заполненную двойной дистиллированной водой. Реплики будут плавать на поверхности воды, пока носители тонут.
Переложите реплики с проволочной петлей на 12-клапанную пластину, заполненную гипоклоритом натрия, и инкубируйте в течение ночи. Мойте реплики в двухдистиллированной воде. Соберите их на сетчатую медную решетку ТМ и дайте высохнуть на воздухе в течение двух часов.
Используйте просвечивающий электронный микроскоп для получения изображений реплик и получения микроснимков. Для точной интерпретации реплик и микроснимков следуйте рекомендациям по правильной ориентации на номенклатуру. Анализы реплик показали, что изолированно-кондиционированная среда содержала обогащенную фракцию везикул.
Изолированные везикулы были либо собраны в кластеры по три или более, либо очень индивидуально распределены. Везикулы имели сферическую форму. Диаметр везикул соответствовал диаметру микровезикул.
Замораживание-разрыв также выявило двумерную организацию мембраны микровезикул. Экзоплазматическая фаза микровезикул имела гладкий, однородный вид, в то время как в фазе протопластов мы наблюдали межмембранные частицы. Межмембранные частицы появлялись спорадически, что подразумевает, что микровезикулы, выделенные из клеток ракового материала, содержат только небольшое количество мембранных белков или белковых сборок.
Подводя итог, можно сказать, что методика замораживания-перелома, используемая в представленном протоколе, оказывается оптимальной методикой для характеристики внеклеточных везикул и может быть использована для оценки других популяций внеклеточных везикул. Важнейшим преимуществом метода замораживания-перелома является его способность разрешать внутреннюю организацию везикул-ограничивающей мембраны, что определяет биологическую функцию внеклеточных везикул.
