Линия клеток O9-1 является очень полезным инструментом для изучения нервных клеток гребня in vitro. Он имеет большой потенциал для использования в широком диапазоне применения в различных областях использования исследований. Клетки O9-1 имеют очевидные преимущества, такие как легкий доступ, и быстрое получение достаточного количества клеток для экспериментов, что делает его мощным методом, дополняя исследования нервных клеток гребня.
Для начала подготовьте базальные средства массовой информации для клеточной культуры O9-1, согласно текстовому протоколу. Затем отфильтруй базальные средства массовой информации и заверните их в фольгу, чтобы защитить его от света. После этого, собирать условные базальные средства массовой информации из активированных ячеек STO в соответствии с текстовым протоколом.
Во-первых, оттаивать алицит мембранной матрицы подвала на льду в течение двух часов. Затем разбавьте мембранную матрицу подвала с помощью фильтрованного стерилизованного DMEM с 10%FBS до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Пальто пластины с матрицы мембраны подвала при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем, аспирировать мембранную матрицу подвала при наклоне пластины. Высушите пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут. При добавлении матрицы мембраны подвала к пластине, убедитесь, что решение охватывает хорошо равномерно для поддержания характеристик клеток и избежать ненужных изменений между экспериментами.
Восстановить O9-1 клетки, поместив крио-флакон в 37 градусов по Цельсию водяной ванны. Медленно закружить флакон, пока раствор полностью превращается в жидкость. После этого перенесите клеточный раствор из крио-виаля в 15 мл центрифугной трубки.
Добавьте пять томов DMEM с 10%FBS в трубку, чтобы повторно приостановить клетки. Центрифуга клетки в течение трех минут при 180 Gs.Then, аспирировать супернатантов, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы. Затем повторно приостанавливайте гранулы в условных базальных средствах массовой информации, дополненных LIF и BFGF.
Семя клеток в шесть хорошо пластины, и агитировать пластины семян клеток равномерно. При агитации пластины, сделать это горизонтально и вертикально, как закрученного пластины приведет к клеткам сосредоточиться к центру. И позволить этим клеткам прикрепляться и расти в стандартном инкубаторе культуры клеток на ночь.
Убедитесь, что ячейки прикреплены перед сменой мультимедиа. Когда клетки O9-1 достигают 80%-ного слияния, оттаивать мембранную матрицу подвала и подготовить мембранную матрицу подвала с покрытием пластины, как описано ранее. Затем добавьте базальные средства массовой информации, дополненные LIF и BFGF, в мембранную матрицу.
Аккуратно промойте колодцы 2 мл DPBS дважды. Затем отмежеваться от клеток с 1 мл 0,05%трипсина ЭДТА при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут. Нейтрализовать трипсин с равным количеством DMEM с 10%FBS, неоднократно трубопроводов жидкости по всей поверхности хорошо.
Затем перенесите клеточный раствор в центрифугу. И центрифуга в течение трех минут при 180 Gs.Aspirate супернатантных, не нарушая гранулы клеток. Далее, повторно использовать гранулы клетки, мягко pippetting условных базальных средств массовой информации, дополненной LIF и BFGF.
Семя клеток на покрытие пластины, как описано ранее. Затем позвольте клеткам прикрепляться и расти в стандартном инкубаторе клеточной культуры. Во-первых, подготовить 2X замораживания средств массовой информации в соответствии с текстовым протоколом.
Затем фильтр-стерилизовать средства массовой информации. Промыть стенки пластины с DPBS в два раза, трубы мягко, чтобы избежать потери клеток. Далее отмежевать клетки с 0,05%трипсина EDTA при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут.
Нейтрализовать трипсин с равным количеством 10%FBS и DMEM. Перенесите содержимое пластины в центрифугу и центрифугу в течение трех минут при 180 Gs.Then, аспирировать супернатент и добавить 2 мл PBS для повторного перерасхода гранул. Центрифуга клеточного раствора еще раз и аспирировать супернатант.
Отрегулируйте количество базальных средств массовой информации в трубке по мере необходимости и добавьте равное количество 2X замораживания мультимедиа. Затем перенесите ячейки на помеченные крио флаконы. Поместите флаконы крио внутри полистирола поле с крышкой для достижения медленной скорости охлаждения на 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 24 часов.
Для выполнения SIRNA нокдаун в O9-1 клеток, восстановить и семян клеток. Разбавить липосомы в соответствующем объеме без сыворотки средств массовой информации. Затем разбавьте SIRNA в безотхо сыворотки средств массовой информации в соответствии с текстовым протоколом.
После этого добавьте разбавленную SIRNA в разбавленные липосомы, в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте раствор с помощью пипетки и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте соответствующий объем липидного комплекса SIRNA к клеткам.
Затем инкубировать клетки в течение 24 часов в стандартном инкубаторе культуры клеток. Клетки O9-1 могут дифференцироваться на различные типы клеток при определенных условиях культуры дифференциации. Чтобы дифференцировать клетки O9-1 в остеопласты, подготовьте остеогенные средства дифференциации в соответствии с текстовым протоколом.
Наконец, обнаружить остеопласт маркер остеокальцина в дифференцированных остеопластов путем иммуно окрашивания. Чтобы дифференцировать O9-1 клетки в гладкие мышечные клетки, культуры их под дифференциации средств массовой информации в соответствии с текстовым протоколом, и оценить дифференциацию с помощью гладкой мышцы актин иммуно окрашивания. В этом протоколе, как выбить и сбить эксперимент по изучению Яп потери функции в O9-1 клетки были выполнены.
При гладких условиях дифференциации мышечных клеток, большинство диких клеток типа O9-1 породили гладкие мышцы актин положительные гладкие мышечные клетки. Yap null клетки однако вообще не сумели продифференцировать в SMA положительные ровные клетки мышцы. Это указывает на то, что Yap играет важную роль в дифференциации нервных клеток гребня в гладкие мышечные клетки.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы справиться с O9-1 клеточной линии мягко и осторожно в течение всего процесса. Убедитесь в том, чтобы разбавить и использовать базальные мембраны матрицы должным образом, и использовать 0,05%трипсина для диссоциации клеток. Не забывайте, что во время подготовки к O9-1 клеточной культуры, работа с митомицином c может быть чрезвычайно опасным, и меры предосторожности, такие как ношение лабораторного пальто и перчаток всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
