Анализ представляет собой важный исследовательский инструмент для моделирования дегрануляций базофилов, вызванных сшиваемыми IgE пациентов и аллергенами. Таким образом, анализ может быть использован для имитации аллергических реакций 1 типа. Анализ является надежным, воспроизводимым и адаптируемым.
Кроме того, он очень чувствителен, так как может быть выполнен с небольшим количеством рекомбинантного или очищенного аллергена или даже со сложными экстрактами аллергена. Метод используется для диагностики аллергии, так как он анализирует реактивность IgE пациентов на аллергены. Также этот метод подходит для анализа перекрестной реактивности и мониторинга эффективности лечения АИТ.
Начните с сбора клеток Ag8 из колбы клеточной культуры и перенесите клетки в центрифугационную трубку. Гранулируют клетки центрифугированием в течение пяти минут, в 250 раз больше г при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу до конечной концентрации примерно в 10 раз больше шестой клетки на миллилитр в гуманизированной среде RBL-клеток.
Разбавьте человеческие сыворотки от одного до 10 в клеточной суспензии Ag8 для окончательного разведения сыворотки от одного до 20 в анализе и инкубируют в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и от пяти до 7% углекислого газа. Когда гуманизированные клетки RBL достигнут 50-90% конфлюентности, тщательно аспирируют среду из колбы культуры клеток T-75, не касаясь прилипающих гуманизированных RBL клеток. Промыть ячейки дважды, добавив 10 миллилитров DPBS на противоположную сторону колбы, а не непосредственно на клетки.
Аспират DPBS, добавляют пять миллилитров предварительно нагретого один раз трипсина-ЭДТА для отслоения клеток и инкубируют в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Осторожно постучите по колбе, чтобы отсоедать ячейки. Перенесите клеточную суспензию в 15-миллиметровую центрифугированную трубку и заполните трубку гуманизированной клеточной средой RBL или DPBS для разбавления трипсина-ЭДТА.
Центрифугировать ячейки в 250 раз в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в пяти миллилитрах гуманизированной клеточной среды RBL для подсчета клеток. После подсчета клеток разводят клетки в гуманизированной RBL клеточной среде для получения конечной концентрации от двух раз 10 до шестой клетки на миллилитр.
Добавьте 50 микролитров гуманизированной суспензии RBL на лунку, что эквивалентно одному умножению 10 к пятой клетке на лунку в стерильной 96-луночной пластине. Центрифугируют предварительно инкубированную суспензию сыворотки Ag8 и переносят 50 микролитров центрифугированной сывороточной суспензии Ag8 в каждую скважину, содержащую гуманизированные клетки RBL, не нарушая гранулу клеток Ag8. Используйте сенсибилизированные нестимулированные клетки без антигена, так как нет контроля антигена для индикации нижнего сигнального плато или фона, и не сенсибилизируйте фон и максимальный контроль лизиса скважин.
Накройте пластину крышкой и высиживайте в течение ночи при 37 градусах Цельсия и от пяти до 7% углекислого газа. Аспирировать сыворотки, содержащие клеточную среду, перевернуть и постучать по пластине на абсорбирующей бумаге, чтобы опорожнить пластину для промывки гуманизированных RBL-клеток. Промыть клетки три раза, добавив 200 микролитров буфера Tyrode на лунку, и инкубировать в течение примерно 30 секунд на стирку в течение первых двух промывок.
После добавления буфера Тирода в третий раз аспирировать буфер и оставить раствор в колодцах до готовности к добавлению разбавления антигена. Переносят 100 микролитров раствора антигена в каждую лунку, содержащую предварительно сенсибилизированные гуманизированные RBL-клетки, но не стимулируют максимальный лизис и несенсибилизированные фоновые клетки антигеном. Добавьте 100 микролитров буфера Tyrode в максимальные контрольные скважины лизиса, несенсибилизированные фоновые контрольные скважины и сенсибилизированные скважины без антигена.
Инкубируют клетки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и от пяти до 7% углекислого газа. Обработайте максимальные контрольные лунки лизиса 10 микролитрами 10% Тритона Х-100 на лунку и правильно перемешайте, чтобы полностью лизировать клетки для 100% высвобождения бета-гексозаминидазы. Добавьте 50 микролитров раствора подложки в новую несвязывающую 96-луночную пластину.
Перенесите 50 микролитров супернатанта из скважин гуманизированных RBL-клеток, содержащих пластину, в новую пластину, содержащую раствор субстрата, и инкубируем пластину в течение одного часа при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить конверсию фторогенного субстрата. Добавьте 100 микролитров остановного раствора на лунку и измерьте флуоресценцию, как описано в тексте рукописи. Колоколообразная кривая, полученная в анализе активности бета-гексозаминидазы, указывает на моновалентное занятие антигенных эпитопов иммуноглобулина Е за счет избытка аллергена, который ингибирует сшивание аллергена иммуноглобулина Е при высоких концентрациях антигена.
Концентрацию антигена, необходимую для половинного максимального высвобождения медиатора, рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа. Анализ жизнеспособности клеток проводили для исключения цитотоксических эффектов, полученных либо от сенсибилизирующей сыворотки, либо от антигена, используемого для стимуляции. Пять различных человеческих сывороток были использованы для анализа активности бета-гексозаминидазы, и четыре из пяти сывороток, полученных из аллергии на пыльцу березы, ответили на стимуляцию Bet v 1, демонстрируя, что Bet v 1 является мощным аллергеном, ответственным за иммуноглобулин Е опосредованные аллергические симптомы.
Оценивали перекрестную реактивность иммуноглобулина Е на гомологичные аллергены. Ответ на Bet v 1 был обнаружен у обоих пациентов, но второй пациент также ответил на Cor a 1. Bet v1 гомологичного пищевого аллергена, указывающего на более высокий уровень Cor a 1 перекрестно-реактивного иммуноглобулина E у второго пациента.
Оценивалась гипоаллергенная природа мутантных вариантов аллергенов и сравнивалась с их аналогом дикого типа. Кривая высвобождения варианта Bet v 1 сдвинулась в сторону более высокой концентрации антигена по сравнению с аллергеном дикого типа, что привело к значительно более высокой концентрации антигена, чтобы спровоцировать половину максимального высвобождения, что делает мутант менее аллергическим и, следовательно, кандидатом на аллерген-специфическую иммунотерапию. Не забывайте оставлять моющие растворы на клетках до применения разбавления антигена, чтобы избежать высыхания клеток, иначе это приведет к плохой производительности анализа.
Анализ может быть использован для многих различных применений, включая стандартизацию аллергенных продуктов, основанных на их биологической активности, таких как растворы для уколов кожи или экстракты, используемые для аллерген-специфической иммунотерапии.
