Методы и методы визуализации, используемые в этом протоколе, представляют собой превосходное представление о безопасности и эффективности генной терапии при ишемическом сердце перед переходом к клиническим испытаниям. Основными преимуществами этого метода являются низкая инвазивность модели ишемии, а также точное нацеливание генной терапии на гипокинетические, но все еще жизнеспособные области сердца. Начните с выполнения трансторакальной эхокардиографии перед операцией по ишемии, переносом генов и эвтаназией, чтобы оценить любую обнаруживаемую перикардиальную жидкость и определить деформацию миокарда.
Поместите датчик в третье или четвертое межреберье под мышкой свиньи маркером, указывающим на грудину свиньи, чтобы получить доступ к парастернальной короткой оси на уровне митрального клапана, папиллярной мышцы и апикального уровня. Затем нажмите «Получить», чтобы сохранить клип. Для выполнения коронарографии непосредственно перед операцией по ишемии используют катетер 6-F под рентгеноскопическим контролем с йодным контрастным веществом для визуализации правой коронарной артерии, левой восходящей коронарной артерии и левой передней нисходящей артерии.
Для киновизуализации в автоинъекторе установите продолжительность болюса в три секунды и общий объем на 21 миллилитр, а затем нажмите одинарно, и да, чтобы ввести контрастное вещество йода в левый желудочек через катетер косички 5-F. Выполните киновизуализацию животного в состоянии покоя, а затем введите добутамин внутривенно и увеличивая дозы для индукции стресса. После достижения целевой частоты сердечных сокращений в 160 ударов в минуту выполняется киновизуализация и удаляется катетер косички.
Чтобы рассчитать фракцию выброса, откройте измерительное программное обеспечение, выберите желудочковый анализ рассматриваемого изображения. Прокрутите изображение, чтобы выбрать таймфрейм, один в диастоле и один в систоле, а затем выберите инструмент для рисования контуров желудочков каждого таймфрейма. Чтобы вызвать хроническую ишемию миокарда, за 14 дней до переноса генов поместите катушку в левую коронарную артерию и перенесите стент с бутылочным горлышком на левую коронарную артерию и поместите стент дистально к первой диагонали.
Надуйте стент до номинального давления в артерии, используя индефлятор с отношением стента к просвету 1,3 для закрепления узкого места на месте. Еще через 15 секунд сдуйте стент, вытяните оборудование из артерии и обеспечьте правильное размещение стента с узким горлышком с помощью ангиографии. После ангиографии и функциональных измерений под рентгеноскопическим контролем введите картирующий катетер в левый желудочек через оболочку бедренной кости для электроанатомического картирования и соберите не менее 100 точек из левого желудочка и нажмите «Принять», чтобы одобрить точку.
В итоговой карте для жизнеспособности в качестве критерия используйте униполярное напряжение свыше пяти милливольт. А при гипокинезии выбирайте локальное линейное укорочение как можно ниже, по крайней мере, до 12%, но желательно ниже 6%После эвтаназии животное извлеките сердце из грудной полости. После того, как собранное сердце будет промыто, поместите иглу 18-го калибра над аортальным клапаном и присоедините иглу к перфузионному насосу.
Перфузируйте сердце 750 миллилитрами 1%-ного параформальдегида. Используйте острый нож, чтобы разрезать сердце на ломтики толщиной в один сантиметр и собрать образцы из области переноса генов в 4% параформальдегид и жидкий азот. Храните образцы для окрашивания в 4% параформальдегиде в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия.
Эффективность генной терапии анализировали путем измерения окружной деформации, фракции выброса и перфузии миокарда с помощью ПЭТ-сканирования 15O-воды. Образцы тканей могут быть собраны непосредственно из области переноса генов путем сравнения сердца с электроанатомической картой. Экспрессию трансгена и терапевтический ангиогенез оценивали с помощью иммуногистологического анализа путем анализа количества положительных клеток после окрашивания бета-галактозидазой и анализа капиллярной области миокарда после окрашивания молекулой адгезии тромбоцитов/эндотелиальных клеток-1.
Важно подтвердить размещение стента с узким горлышком с помощью ангиограммы и сбора образца из области переноса генов, что может быть подтверждено путем сравнения сердца с электроанатомической картой. В целом, крайне важно сделать все измерения наиболее воспроизводимым способом.
