Los métodos y modalidades de imagen utilizados en este protocolo constituyen una excelente imagen de la seguridad y eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico antes de proceder a los ensayos clínicos. Las principales ventajas de esta técnica son la baja invasividad del modelo de isquemia, pero también la orientación precisa de la terapia génica a áreas hipocinéticas pero aún viables del corazón. Comience realizando la ecocardiografía transtorácica antes de la operación de isquemia, la transferencia de genes y la eutanasia para evaluar cualquier líquido pericárdico detectable y determinar la tensión miocárdica.
Coloque el transductor en el tercer o cuarto espacio intercostal debajo de la axila del cerdo con un marcador que apunte al esternón del cerdo para acceder a las vistas paraesternales de eje corto a nivel de la válvula mitral, el músculo papilar y los niveles apical. Luego presione adquirir para guardar un clip. Para realizar la angiografía coronaria directamente antes de la operación de isquemia, use un catéter 6-F bajo guía fluoroscópica con un agente de contraste de yodo para obtener imágenes de la arteria coronaria derecha, la arteria coronaria ascendente izquierda y la arteria descendente anterior izquierda.
Para imágenes de cine en el autoinyector, ajuste la duración del bolo en tres segundos y el volumen total para 21 mililitros, y luego presione simple, y sí para administrar agente de contraste de yodo en el ventrículo izquierdo a través de un catéter de coleta 5-F. Realizar imágenes de cine del animal en reposo y luego administrar dobutamina por vía intravenosa y dosis crecientes para la inducción de estrés. Una vez que se alcanza la frecuencia cardíaca objetivo de 160 latidos por minuto, se realiza una imagen de cine y se retira el catéter pigtail.
Para calcular la fracción de eyección abra el software de medición, seleccione análisis ventricular de la imagen en cuestión. Desplácese por la imagen para seleccionar un período de tiempo, uno en diástole y otro en sístole, y luego seleccione una herramienta para dibujar contornos ventriculares de cada período de tiempo. Para inducir la isquemia miocárdica crónica, 14 días antes de la transferencia de genes, coloque una bobina en la arteria coronaria izquierda, deslice el stent del cuello de botella hasta la arteria coronaria izquierda, y coloque el stent distalmente en la primera diagonal.
Infle el stent a la presión nominal en la arteria, utilizando un indeflactor con una relación stent/lumen de 1,3 para anclar el cuello de botella en su lugar. Después de 15 segundos adicionales, desinfle el stent, retraiga el equipo de la arteria y asegúrese de colocar correctamente un stent de cuello de botella mediante angiografía. Después de la angiografía y las mediciones funcionales bajo guía fluoroscópica, introduzca un catéter de mapeo en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral para el mapeo electroanatómico, y recoja al menos 100 puntos del ventrículo izquierdo, y haga clic en aceptar para aprobar un punto.
En el mapa final, para la viabilidad, use un voltaje unipolar de más de cinco milivoltios como criterio. Y para la hipocinesia, seleccione un acortamiento lineal local lo más bajo posible, al menos tan bajo como 12%, pero preferiblemente por debajo del 6% Después de sacrificar al animal, extraiga el corazón de la cavidad torácica. Una vez que se enjuague el corazón extraído, coloque una aguja de calibre 18 sobre la válvula aórtica y conecte la aguja a una bomba de perfusión.
Perfundir el corazón con 750 mililitros de paraformaldehído al 1%. Use un cuchillo afilado para cortar el corazón en rodajas de un centímetro de grosor y recoja las muestras del área de transferencia de genes en paraformaldehído al 4% y nitrógeno líquido. Almacene las muestras para teñir en paraformaldehído al 4% durante 48 horas a cuatro grados centígrados.
La eficacia de la terapia génica se analizó midiendo la tensión circunferencial, la fracción de eyección y la perfusión miocárdica mediante una exploración PET de 15O-agua. Las muestras de tejido se pueden recolectar directamente del área de transferencia de genes, comparando el corazón con el mapa electroanatómico. La expresión transgénica y la angiogénesis terapéutica se evaluaron mediante análisis histológico inmune mediante el análisis del número de células positivas después de la tinción de Beta-galactosidasa, y mediante el análisis del área capilar miocárdica, después de la tinción de la molécula-1 de adhesión plaquetaria/célula endotelial.
Es importante confirmar la colocación del stent de cuello de botella mediante angiografía y recolección de muestras del área de transferencia de genes, lo que podría confirmarse comparando el corazón con el mapa electroanatómico. En general, es crucial hacer todas las mediciones de la manera más reproducible.
