I metodi e le modalità di imaging utilizzati in questo protocollo costituiscono un'immagine eccellente della sicurezza e dell'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico prima di procedere agli studi clinici. I principali vantaggi di questa tecnica sono la bassa invasività del modello ischemico, ma anche il preciso targeting della terapia genica verso aree ipocinetiche ma ancora vitali del cuore. Inizia eseguendo l'ecocardiografia transtoracica prima dell'operazione di ischemia, il trasferimento genico e l'eutanasia per valutare qualsiasi liquido pericardico rilevabile e determinare il ceppo miocardico.
Posizionare il trasduttore nel terzo o quarto spazio intercostale sotto l'ascella del maiale con un marcatore che punta allo sterno del maiale per accedere alle viste dell'asse corto parasternale a livello della valvola mitrale, del muscolo papillare e dei livelli apicali. Quindi premere acquisisci per salvare una clip. Per eseguire l'angiografia coronarica direttamente prima dell'operazione di ischemia utilizzare un catetere 6-F sotto guida fluoroscopica con un mezzo di contrasto di iodio per visualizzare l'arteria coronaria destra, l'arteria coronaria ascendente sinistra e l'arteria discendente anteriore sinistra.
Per l'imaging cinematografico nell'autoiniettore, impostare la durata del bolo a tre secondi e il volume totale per 21 millilitri, quindi premere singolo e sì per somministrare il mezzo di contrasto allo iodio nel ventricolo sinistro tramite un catetere a coda di maiale 5-F. Eseguire l'imaging cinematografico dell'animale a riposo e quindi somministrare dobutamina per via endovenosa e dosi crescenti per l'induzione dello stress. Una volta raggiunta la frequenza cardiaca target di 160 battiti al minuto, esegue l'imaging cinematografico e rimuove il catetere pigtail.
Per calcolare la frazione di eiezione aprire il software di misura, selezionare l'analisi ventricolare dell'immagine in questione. Scorrere l'immagine per selezionare un intervallo di tempo, uno in diastole e uno in sistole, quindi selezionare uno strumento per disegnare i contorni ventricolari di ciascun intervallo di tempo. Per indurre l'ischemia miocardica cronica, 14 giorni prima del trasferimento genico, posizionare una bobina sull'arteria coronaria sinistra e far scorrere lo stent a collo di bottiglia sull'arteria coronaria sinistra e posizionare lo stent distalmente alla prima diagonale.
Gonfiare lo stent alla pressione nominale nell'arteria, utilizzando un indeflatore con un rapporto stent/lume di 1,3 per ancorare il collo di bottiglia in posizione. Dopo altri 15 secondi, sgonfiare lo stent, ritrarre l'apparecchiatura dall'arteria e garantire il corretto posizionamento di uno stent a collo di bottiglia mediante angiografia. Dopo l'angiografia e le misurazioni funzionali sotto guida fluoroscopica, introdurre un catetere di mappatura al ventricolo sinistro attraverso la guaina femorale per la mappatura elettroanatomica e raccogliere almeno 100 punti dal ventricolo sinistro e fare clic su accetta per approvare un punto.
Nella mappa finale, per la vitalità, utilizzare una tensione unipolare su cinque millivolt come criterio. E per l'ipocinesia, selezionare un accorciamento lineare locale il più basso possibile, almeno fino al 12% ma preferibilmente inferiore al 6%Dopo l'eutanasia dell'animale, raccogliere il cuore dalla cavità toracica. Una volta che il cuore raccolto è stato risciacquato, posizionare un ago di gauge 18 sopra la valvola aortica e collegare l'ago a una pompa di perfusione.
Perfondere il cuore con 750 millilitri di paraformaldeide all'1%. Utilizzare un coltello affilato per tagliare il cuore in fette spesse un centimetro e raccogliere i campioni dall'area di trasferimento genico in paraformaldeide al 4% e azoto liquido. Conservare i campioni per la colorazione in paraformaldeide al 4% per 48 ore a quattro gradi Celsius.
L'efficacia della terapia genica è stata analizzata misurando il ceppo circonferenziale, la frazione di eiezione e la perfusione miocardica mediante scansione PET 15O-acqua. I campioni di tessuto possono essere raccolti direttamente dall'area di trasferimento genico, confrontando il cuore con la mappa elettroanatomica. L'espressione del transgene e l'angiogenesi terapeutica sono state valutate attraverso l'analisi istologica immunitaria analizzando il numero di cellule positive dopo colorazione della beta-galattosidasi e analizzando l'area capillare miocardica, dopo colorazione della molecola di adesione piastrinica/endoteliale-1.
È importante confermare il posizionamento dello stent a collo di bottiglia tramite angiogramma e raccolta di campioni dall'area di trasferimento genico, che potrebbe essere confermata confrontando il cuore con la mappa elettroanatomica. Nel complesso, è fondamentale effettuare tutte le misurazioni nel modo più riproducibile.
