Этот метод был разработан для количественной оценки контакт-зависимой конкуренции через систему секреции типа VI между бактериальными штаммами на уровне одной клетки. Этот метод использует общую площадь клеток, а не количество клеток для количественной оценки бактериальных соревнований, что облегчает исследователям доступ к проприетарному программному обеспечению для анализа изображений. Этот метод может быть легко модифицирован для количественной оценки конкуренции между различными культивируемыми микробами.
Кроме того, экспериментальная установка может быть оптимизирована для использования на вертикальных или перевернутых микроскопах. Для начала приготовьте раствор агарозной прокладки, растворив 2% агарозу с низким содержанием расплава в морском PBS. Нагревайте раствор ненадолго в течение примерно 30 секунд в микроволновой печи и вихрь, пока агароза полностью не растворится.
Держите этот раствор на водяной бане с 55 градусами Цельсия до готовности к использованию. Затем оберните кусок лабораторной ленты вокруг стеклянного слайда пять раз. Повторите обмотку ленты на одном и том же слайде, чтобы расстояние между двумя частями ленты было немного меньше ширины обложек.
Чтобы обеспечить плоскую поверхность агаровой прокладки, пипетку нагревают раствор агарозы между двумя кусками ленты и сразу же кладут сверху на крышку так, чтобы крышка контактирует с жидкостью и выталкивает любые пузырьки в растворе агарозы. Дайте агарозной прокладке затвердеть при комнатной температуре не менее одного часа. Затем разрежьте эту агарозную подушечку лезвием бритвы на четыре 5 квадратных миллиметровых подушечки для использования для визуализации.
Чтобы подготовить штаммы к совместной инкубации, вытрите каждый штамм из замороженных запасов на агаровые пластины LBS, дополненные соответствующими антибиотиками, и инкубируем в течение ночи при 24 градусах Цельсия. На следующий день выберите две колонии из каждого штамма и повторно суспендируем колонии в среде LBS, дополненной антибиотиками. Инкубировать повторно суспендированные колонии на ночь при 24 градусах Цельсия с встряхиванием со скоростью 200 оборотов в минуту.
На следующее утро субкультура каждой биологической реплицирует одну в 1000 раз свежую среду LBS без антибиотиков и инкубируется до тех пор, пока клетки не достигнут оптической плотности около 1,5 при 600 нанометрах. Измерьте и запишите оптическую плотность на уровне 600 нанометров для всех образцов. Нормализуйте каждый образец до оптической плотности единицы, разбавляя культуру средой LBS.
Смешайте два конкурирующих штамма в равном соотношении, добавив 30 микролитров каждого нормализованного штамма в меченую трубку размером 1,5 миллилитра. Вихрь культуры смешанного штамма в течение одной-двух секунд. Смешайте конкурирующие штаммы для каждого биологического реплики и обработки, чтобы получить в общей сложности четыре смешанных стрейн-трубки.
Концентрируйте каждую смешанную культуру в три раза путем центрифугирования, чтобы обеспечить достаточно плотные конкурирующие клетки для контакт-зависимого уничтожения во время совместной инкубации. Выбросьте супернатант, повторно суспендьте каждую гранулу в 20 микролитрах среды LBS и выполните процедуры концентрации для каждого образца. Если вы проводите визуализацию на перевернутом микроскопе, начните с обнаружения двух микролитров смешанной культуры на дне крышки no 1,5 35-миллиметровой чашки Петри и поместите агарозную прокладку над пятном совместной инкубации.
Поместите 12-миллиметровый круглый стеклянный покров поверх агаровной прокладки. Повторная пятнистость и размещение покрова для оставшихся трех смешанных культур, в результате чего будут изображены четыре блюда. Прежде чем продолжить, дайте слайдам посидеть на столешницы около пяти минут, чтобы клетки осели на агаровой подушке, чтобы избежать движения во время процесса визуализации.
Начните с фокусировки на клетках с помощью DIC, чтобы свести к минимуму эффекты фотоотбеливания. Основываясь на среднем размере одной бактериальной клетки, используйте масляный объектив 100X. Настройте время экспозиции и параметры захвата для каждого канала с минимальным обнаружением фона.
Выберите не менее пяти полей зрения и получайте изображения в каждом соответствующем канале. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и импортируйте файлы изображений для анализа. Преобразуйте изображение в оттенки серого, разделите каналы и начните с пороговых значений и создания двоичной маски предварительно обработанного изображения.
Выберите Анализ, затем в раскрывающемся меню выберите Задать масштаб и введите соответствующие значения для настройки микроскопии. Затем перейдите к настройкам измерений и выберите Область. На вкладке Анализ выберите Анализировать частицы с использованием настроек по умолчанию.
Если в образце присутствует мусор, размер или цикличность могут быть скорректированы для фильтрации неэлекулочных частиц. Выберите Показать, а затем Контуры, чтобы результаты анализа фильтрации включали пронумерованный контур всех анализируемых частиц. Экспортируйте измерения в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа и построения графиков.
Показаны репрезентативные флуоресцентные изображения каждого экспериментального лечения. Концентрация смешанной культуры перед кровянистым путем приводила к округлению или исчезновению клеток-мишеней в течение двух часов, что указывает на успешное ингибирование. Когда смешанная культура не концентрируется, клетки остаются рассеянными на слайде.
Без достаточного межклеточного контакта штамм-мишень не ингибируется смертельным штаммом. Клетки-мишени не исчезали и не округлялись при совместной инкубации с мутантом T6SS в переполненных или рассеянных условиях. Таким образом, мишень была раскована ни в одном из методов лечения.
Результаты анализа частиц были отортированы и проанализированы как для целевого штамма, так и для ингибиторного штамма. Более 100% начальной целевой области в конечный момент времени представляет собой чистое увеличение целевого показателя, а менее 100% первоначальной целевой области указывает на чистое снижение целевого показателя. Чистый рост штамма ингибитора наблюдался во всех методах лечения.
Тем не менее, процент начальной площади для штамма ингибитора был значительно выше, когда ингибитор дикого типа был совместно инкубирован с мишенью в переполненных условиях по сравнению со всеми другими методами лечения. Чтобы получить четкие изображения, агарозная подушка должна быть как можно более плоской. Отрежьте кусочки ленты, прежде чем обернуть их вокруг слайда, чтобы убедиться, что они одинаковой длины.
