Bu yöntem, tek hücre düzeyinde bakteri suşları arasındaki tip VI salgı sistemi ile temasa bağımlı rekabeti ölçmek için tasarlanmıştır. Bu teknik, bakteriyel rekabetleri ölçmek için hücre sayıları yerine toplam hücre alanını kullanır ve tescilli görüntü analizi yazılımı erişimi olmayan araştırmacıların erişimini kolaylaştırır. Bu yöntem, çeşitli kült mikroplar arasındaki rekabeti ölçmek için kolayca değiştirilebilir.
Ayrıca, deneysel kurulum dik veya ters mikroskoplarda kullanılmak üzere optimize edilebilir. Başlangıç olarak, % 2 düşük eriyik agarose'yi deniz PBS'sine eriterek agarose ped çözeltisini hazırlayın. Agarose tamamen çözünene kadar çözeltiyi mikrodalgada ve girdapta yaklaşık 30 saniye ısıtın.
Bu çözeltiyi kullanıma hazır olana kadar 55 santigrat derecelik bir su banyosunda tutun. Sonra, bir laboratuvar kaseti parçasını cam bir kaydırağın etrafına beş kez sarın. Bandın aynı slaytta kaydırılır, böylece iki bant parçası arasındaki mesafe kapak genişliğine göre biraz daha küçüktür.
Düz bir agarose ped yüzeyi sağlamak için, pipet iki bant parçası arasında sıcak agarose çözeltisi ve hemen üzerine bir kapak ki, kapak sıvısı sıvı ile temas eder ve agarose çözeltisinde kabarcıkları dışarı iter. Agarose pedinin oda sıcaklığında en az bir saat katılaşmasını bırakın. Daha sonra bu agarose pedi bir jiletle görüntüleme için kullanılacak dört 5 milimetrelik pedlere kesin.
Suşları ko-inkübasyona hazırlamak için, dondurulmuş stoklardaki her bir suşu uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LBS agar plakalarına serin ve gece boyunca 24 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, her suştan iki koloni seçin ve antibiyotik takviyeli LBS ortamında kolonileri yeniden canlandırın. Bir gecede 24 santigrat derecede yeniden canlanan kolonileri dakikada 200 dönüşte sallanarak kuluçkaya yatırın.
Ertesi sabah, alt kültür her biyolojik antibiyotiksiz 1.000 kat taze LBS ortamına çoğalır ve hücreler 600 nanometrede yaklaşık 1,5 optik yoğunluğa ulaşana kadar kuluçkaya yaslar. Optik yoğunluğu tüm numuneler için 600 nanometre olarak ölçün ve kaydedin. Kültürü LBS ortamıyla seyrelterek her örneği bir optik yoğunluğa normalleştirin.
Etiketli 1,5 mililitrelik bir tüpe normalleştirilmiş her bir suşun 30 mikrolitresini ekleyerek iki rakip suşları eşit oranda karıştırın. Vortex karışık gerinim kültürü bir ila iki saniye. Toplam dört karışık gerinim tüpü oluşturmak için her biyolojik çoğaltma ve tedavi için rakip suşları karıştırın.
Eş inkübasyon sırasında temasa bağımlı öldürme için yeterince yoğun rakip hücreler sağlamak için santrifüjleme yaparak her karma kültürü üç kat konsantre edin. Süpernatantı atın, her peletin 20 mikrolitre LBS ortamına yeniden harcayın ve her numune için konsantrasyon prosedürleri uygulayın. Ters bir mikroskopta görüntüleme varsa, karışık bir kültürün iki mikrolitresini 35 milimetrelik petri kabının 1,5 kapak tabanına tespit ederek başlayın ve agarose pedi ortak kuluçka noktasının üzerine yerleştirin.
Agarose pad üzerine 12 milimetre dairesel cam kapaklı yerleştirin. Kalan üç karışık kültür için örtüyü tespit etmeyi ve yerleştirmeyi tekrarlayın, bu da dört yemeğin görüntülenerek sonuçlanmasına neden olur. Devam etmeden önce, görüntüleme işlemi sırasında hareketten kaçınmak için hücrelerin agar pedine yerleşmesine izin vermek için slaytların yaklaşık beş dakika boyunca tezgah üstünde oturmasına izin verin.
Fotobleaching efektlerini en aza indirmek için DIC kullanarak hücrelere odaklanarak başlayın. Tek bir bakteri hücresinin ortalama büyüklüğüne bağlı olarak, 100X yağ hedefi kullanın. En az arka plan algılama ile her kanal için pozlama süresini ve edinme ayarlarını yapın.
En az beş görüntüleme alanı seçin ve her uygun kanalda görüntü alın. Görüntü analiz yazılımını açın ve analiz edilecek görüntü dosyalarını içe aktarın. Görüntüyü gri tonlamalıya dönüştürün, kanalları ayırın ve önceden işlenmiş görüntünün ikili maskesini eşikleyip oluşturarak başlayın.
Çözümle'yi seçin, sonra açılır menüden Ölçeği Ayarla'yı seçin ve mikroskopi kurulumu için uygun değerleri girin. Ardından, ölçümleri ayarlamaya gidin ve Alan'ı seçin. Çözümle sekmesi altında, varsayılan ayarları kullanarak parçacıkları çözümle'yi seçin.
Numunede döküntü varsa, boyut veya döngüsellik hücre dışı parçacıkları filtrelemek için ayarlanabilir. Filtre çıkış analizinin çıktısının analiz edilen tüm parçacıkların numaralı bir anahattını içermesi için Göster ve sonra Anahatlar'ı seçin. Daha fazla analiz ve grafik için ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın.
Her deneysel tedavinin temsili floresan görüntüleri gösterilmiştir. Tespit etmeden önce karma kültürün yoğunlaşması, iki saat içinde yuvarlatılmış veya kaybolmuş hedef hücrelere neden oldu ve bu da başarılı inhibisyona işaret etti. Karma kültür yoğunlaşmadığında, hücreler slaytta dağınık kalır.
Yeterli hücreden hücreye temas olmadan, hedef suş ölümcül suş tarafından engellenmez. Hedef hücreler, kalabalık veya dağınık koşullarda bir T6SS mutantıyla birlikte kuvüründünde ne kayboldu ne de yuvarlandı. Böylece her iki tedavide de hedef sınır tanımayan bir hedefti.
Parçacık analiz sonuçları hem hedef gerinim hem de inhibitör suşu için grafiklendi ve analiz edildi. Son zaman noktasındaki ilk hedef alanın %100'ünden fazlası hedefte net bir artışa işaret eder ve ilk hedef alanın %100'ünden daha düşük olması hedefte net bir düşüş olduğunu gösterir. Tüm tedavilerde inhibitör suşunun net büyümesi gözlendi.
Bununla birlikte, diğer tüm tedavilere kıyasla kalabalık koşullarda hedefle birlikte bir vahşi tip inhibitör inkübe edildiğinde inhibitör suşu için başlangıç alanının yüzdesi önemli ölçüde daha yüksekti. Net görüntüler elde etmek için, agarose pad'in mümkün olduğunca düz olması gerekir. Bant parçalarını kaydırağın etrafına sarmadan önce keserek aynı uzunlukta olduklarından emin olun.
