وقد صممت هذه الطريقة لتحديد المنافسة التي تعتمد على الاتصال عن طريق نظام إفراز النوع السادس بين السلالات البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة. تستخدم هذه التقنية إجمالي مساحة الخلية بدلا من عدد الخلايا لتحديد المسابقات البكتيرية ، مما يجعل من السهل على الباحثين الذين لا يملكون إمكانية الوصول إلى برامج تحليل الصور. ويمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لتحديد المنافسة بين الميكروبات المتنوعة القابلة للطائفة.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين الإعداد التجريبي للاستخدام على المجاهر المستقيمة أو المقلوبة. لتبدأ، وإعداد حل لوحة agarose عن طريق حل 2٪ منخفضة تذوب agarose في برنامج تلفزيوني البحرية. سخني المحلول لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية في الميكروويف ودوامة حتى يذوب الآغروز تماما.
الحفاظ على هذا الحل في حمام مائي 55 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. بعد ذلك، لف قطعة من شريط المختبر حول شريحة زجاجية خمس مرات. كرر التفاف الشريط على نفس الشريحة، بحيث تكون المسافة بين قطعتي الشريط أصغر قليلا من عرض غطاء.
لضمان سطح لوحة agarose شقة، ماصة حل agarose الحارة بين قطعتين من الشريط وعلى الفور وضع غطاء على رأس بحيث coverslip يجعل الاتصال مع السائل ويدفع بها أي فقاعات في محلول الآغاروز. دع لوحة الآغروز تتوطد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم قطع هذه وسادة agarose مع شفرة حلاقة إلى أربع منصات 5 ملليمتر مربع لاستخدامها في التصوير.
لإعداد سلالات للحضانة المشتركة، سلسلة من كل سلالة من المخزونات المجمدة على لوحات أجار LBS تكملها المضادات الحيوية المناسبة واحتضان بين عشية وضحاها في 24 درجة مئوية. في اليوم التالي، واختيار مستعمرتين من كل سلالة وإعادة إنفاق المستعمرات في المضادات الحيوية تكمل LBS المتوسطة. حضانة المستعمرات التي أعيد إنفاقها بين عشية وضحاها في 24 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 تناوب في الدقيقة الواحدة.
في صباح اليوم التالي، كل ثقافة فرعية تكرار واحد إلى 1،000 مرة متوسطة LBS الطازجة دون المضادات الحيوية واحتضان حتى تصل الخلايا إلى كثافة بصرية من حوالي 1.5 في 600 نانومتر. قياس وتسجيل الكثافة البصرية في 600 نانومتر لجميع العينات. تطبيع كل عينة إلى كثافة بصرية واحدة عن طريق تمييع الثقافة مع LBS المتوسطة.
امزج بين السلالات المتنافسة بنسبة متساوية بإضافة 30 ميكرولتر من كل سلالة طبيعية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. دوامة ثقافة سلالة مختلطة لمدة ثانية إلى ثانيتين. خلط السلالات المتنافسة لكل تكرار البيولوجية والعلاج لتوليد ما مجموعه أربعة أنابيب سلالة مختلطة.
ركز كل ثقافة مختلطة ثلاثة أضعاف عن طريق الطرد المركزي لضمان وجود خلايا متنافسة كثيفة بما فيه الكفاية للقتل المعتمد على الاتصال أثناء الحضانة المشتركة. تجاهل supernatant، resuspend كل بيليه في 20 ميكرولتر من LBS المتوسطة وإجراء إجراءات التركيز لكل عينة. إذا كان التصوير على المجهر المقلوب ، تبدأ باكتشاف اثنين من microliters من ثقافة مختلطة على الجزء السفلي من عدد 1.5 coverslip طبق بيتري 35 ملليمتر ووضع لوحة agarose على بقعة الحضانة المشتركة.
ضع غطاء زجاجي دائري عيار 12 ملليمترا فوق لوحة الآغاروز. تكرار اكتشاف ووضع غطاء للثقافات المختلطة الثلاث المتبقية ، مما سيؤدي إلى تصوير أربعة أطباق. قبل المضي قدما، دع الشرائح تجلس على قمة المقعد لمدة خمس دقائق تقريبا للسماح للخلايا بالاستقرار على لوحة أجار لتجنب الحركة أثناء عملية التصوير.
ابدأ بالتركيز على الخلايا التي تستخدم DIC لتقليل تأثيرات bleaching الضوئي. استنادا إلى متوسط حجم خلية بكتيرية واحدة، استخدم هدف زيت 100X. ضبط وقت التعرض وإعدادات اكتساب لكل قناة مع الكشف عن الخلفية الحد الأدنى.
حدد خمسة حقول رؤية على الأقل والحصول على الصور في كل قناة مناسبة. افتح برنامج تحليل الصور واستورد ملفات الصور المطلوب تحليلها. تحويل الصورة إلى تدرج رمادي، وفصل القنوات، وتبدأ عن طريق العتبة وإنشاء قناع ثنائي للصورة المعالجة مسبقا.
حدد تحليل، ثم من القائمة المنسدلة، وحدد تعيين مقياس وأدخل القيم المناسبة لإعداد المجهر. بعد ذلك، انتقل إلى تعيين القياسات وحدد المنطقة. ضمن علامة التبويب تحليل، حدد تحليل الجسيمات باستخدام الإعدادات الافتراضية.
وإذا كان الحطام موجودا في العينة، يمكن تعديل الحجم أو التعميم لتصفية الجسيمات غير الخلوية. حدد إظهار ثم الخطوط العريضة بحيث يتضمن إخراج تحليل التصفية مخططا تفصيليا مرقما لجميع الجسيمات التي تم تحليلها. تصدير القياسات إلى برامج جداول البيانات لمزيد من التحليل والرسوم البيانية.
يتم عرض الصور الفلورية التمثيلية لكل علاج تجريبي. أدى تركيز الثقافة المختلطة قبل الاكتشاف إلى خلايا مستهدفة مستديرة أو اختفت على مدى ساعتين ، مما يشير إلى تثبيط ناجح. عندما لا تتركز الثقافة المختلطة، تبقى الخلايا مشتتة على الشريحة.
وبدون اتصال كاف من خلية إلى خلية، لا تمنع السلالة المستهدفة من السلالة القاتلة. ولم تختف الخلايا المستهدفة ولم تصبح مدورة عندما شاركت في احتضان متحولة من T6SS في ظروف مزدحمة أو مشتتة. وهكذا، لم يتم تحديد الهدف في أي من العلاجين.
تم رسم نتائج تحليل الجسيمات وتحليلها لكل من السلالة المستهدفة وسلالة المانع. ويمثل أكبر من 100٪ من المنطقة المستهدفة الأولية في النقطة الزمنية النهائية زيادة صافية في الهدف، وأشار أقل من 100٪ من المنطقة المستهدفة الأولية إلى انخفاض صافي في الهدف. لوحظ النمو الصافي لسلالة المانع في جميع العلاجات.
ومع ذلك ، كانت نسبة المنطقة الأولية لسلالة المانع أعلى بكثير عندما تم احتضان مثبط من النوع البري مع الهدف في ظروف مزدحمة مقارنة بجميع العلاجات الأخرى. للحصول على صور واضحة ، يجب أن تكون لوحة الآغاروز مسطحة قدر الإمكان. قطع قطع الشريط قبل التفاف عليها حول الشريحة للتأكد من أنها هي نفس الطول.
