Diese Methode wurde entwickelt, um die kontaktabhängige Konkurrenz über das Typ-VI-Sekretionssystem zwischen Bakterienstämmen auf Einzelzellebene zu quantifizieren. Diese Technik verwendet die gesamte Zellfläche anstelle der Zellzahl, um bakterielle Wettbewerbe zu quantifizieren, was es Forschern ohne proprietären Zugriff auf Bildanalysesoftware leicht macht. Diese Methode kann leicht modifiziert werden, um den Wettbewerb zwischen verschiedenen kultivierbaren Mikroben zu quantifizieren.
Darüber hinaus kann der Versuchsaufbau für den Einsatz an aufrechten oder invertierten Mikroskopen optimiert werden. Bereiten Sie zunächst die Agarose-Pad-Lösung vor, indem Sie 2% low melt agarose in marine PBS auflösen. Erhitzen Sie die Lösung kurz für etwa 30 Sekunden in der Mikrowelle und im Wirbel, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
Bewahren Sie diese Lösung in einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bis sie gebrauchsfertig ist. Als nächstes wickeln Sie fünfmal ein Stück Laborband um einen Glasträger. Wiederholen Sie das Umwickeln des Klebebands auf demselben Dia, so dass der Abstand zwischen den beiden Bandstücken etwas kleiner ist als die Deckrutschbreite.
Um eine flache Agarose-Pad-Oberfläche zu gewährleisten, pipetieren Sie warme Agarose-Lösung zwischen den beiden Bandstücken und legen Sie sofort einen Deckslip darauf, so dass der Deckslip mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt und alle Blasen in der Agaroselösung herausdrückt. Lassen Sie das Agarose-Pad mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur erstarren. Schneiden Sie dann dieses Agarose-Pad mit einer Rasierklinge in vier 5-Quadrat-Millimeter-Pads, die für die Bildgebung verwendet werden.
Um die Stämme für die Co-Inkubation vorzubereiten, streichen Sie jeden Stamm aus gefrorenen Beständen auf die lbS-Agarplatten, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika, und inkubieren Sie über Nacht bei 24 Grad Celsius. Am nächsten Tag wählen Sie zwei Kolonien aus jedem Stamm und resuspendieren die Kolonien in antibiotikaergänziertem LBS-Medium. Inkubieren Sie resuspendierte Kolonien über Nacht bei 24 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
Am nächsten Morgen repliziert die Subkultur jedes biologischen Eins in 1.000 mal frisches LBS-Medium ohne Antibiotika und inkubiert, bis die Zellen eine optische Dichte von etwa 1,5 bei 600 Nanometern erreichen. Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern für alle Proben. Normalisieren Sie jede Probe auf eine optische Dichte von eins, indem Sie die Kultur mit LBS-Medium verdünnen.
Mischen Sie die beiden konkurrierenden Stämme in einem gleichen Verhältnis, indem Sie 30 Mikroliter jeder normalisierten Dehnung zu einem markierten 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Wirbeln Sie die Mischkultur für ein bis zwei Sekunden vor. Mischen Sie die konkurrierenden Stämme für jedes biologische Replikat und jede Behandlung, um insgesamt vier gemischte Stammröhrchen zu erzeugen.
Konzentrieren Sie jede Mischkultur dreifach durch Zentrifugieren, um ausreichend dichte konkurrierende Zellen für eine kontaktabhängige Abtötung während der Co-Inkubation zu gewährleisten. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie jedes Pellet in 20 Mikroliter LBS-Medium und führen Sie Konzentrationsverfahren für jede Probe durch. Wenn Sie auf einem invertierten Mikroskop abbilden, beginnen Sie mit dem Spott von zwei Mikrolitern einer Mischkultur auf dem Coverlip-Boden mit der Nummer 1,5 einer 35-Millimeter-Petrischale und legen Sie das Agarose-Pad über den Co-Inkubationspunkt.
Legen Sie einen 12 Millimeter kreisförmigen Glasdeckel über das Agarose-Pad. Wiederholen Sie das Spotting und Platzieren von Coverslip für die verbleibenden drei Mischkulturen, was dazu führt, dass vier Gerichte abgebildet werden. Bevor Sie fortfahren, lassen Sie die Dias etwa fünf Minuten lang auf der Tischplatte sitzen, damit sich die Zellen auf dem Agarpad absetzen können, um Bewegungen während des Bildgebungsprozesses zu vermeiden.
Beginnen Sie mit der Fokussierung auf Zellen mit DIC, um Photobleaching-Effekte zu minimieren. Basierend auf der durchschnittlichen Größe einer einzelnen Bakterienzelle verwenden Sie ein 100-faches Ölobjektiv. Passen Sie die Belichtungszeit und die Aufnahmeeinstellungen für jeden Kanal mit minimaler Hintergrunderkennung an.
Wählen Sie mindestens fünf Sichtfelder aus und erfassen Sie Bilder in jedem geeigneten Kanal. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware und importieren Sie die zu analysierenden Bilddateien. Konvertieren Sie das Bild in Graustufen, trennen Sie die Kanäle und beginnen Sie mit dem Schwellenwert und erstellen Sie eine binäre Maske des vorverarbeiteten Bildes.
Wählen Sie Analysieren, dann wählen Sie im Dropdown-Menü Skalierung festlegen und geben Sie die entsprechenden Werte für die Mikroskopieeinrichtung ein. Gehen Sie als Nächstes zu Messungen festlegen und wählen Sie Bereich. Wählen Sie auf der Registerkarte Analysieren die Option Partikel mit den Standardeinstellungen analysieren aus.
Wenn Ablagerungen in der Probe vorhanden sind, kann die Größe oder Zirkularität angepasst werden, um Nicht-Zellpartikel herauszufiltern. Wählen Sie Anzeigen und dann Konturen aus, damit die Ausgabe der Filteranalyse einen nummerierten Umriss aller analysierten Partikel enthält. Exportieren Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware für weitere Analysen und Grafiken.
Die repräsentativen Fluoreszenzbilder jeder experimentellen Behandlung werden gezeigt. Die Konzentration der Mischkultur vor dem Spotting führte über zwei Stunden zu abgerundeten oder verschwundenen Zielzellen, was auf eine erfolgreiche Hemmung hindeutet. Wenn die Mischkultur nicht konzentriert ist, bleiben die Zellen auf dem Objektträger verteilt.
Ohne ausreichenden Zell-zu-Zell-Kontakt wird der Zielstamm nicht durch den tödlichen Stamm gehemmt. Die Zielzellen verschwanden weder und wurden auch nicht abgerundet, wenn sie mit einer T6SS-Mutante unter überfüllten oder verteilten Bedingungen koinubiert wurden. Somit war das Ziel in beiden Behandlungen ungehemmt.
Die Ergebnisse der Partikelanalyse wurden grafisch dargestellt und sowohl für den Zielstamm als auch für den Inhibitorstamm analysiert. Mehr als 100 % des ursprünglichen Zielgebiets zum letzten Zeitpunkt stellen eine Nettoerhöhung des Ziels dar, und weniger als 100 % des ursprünglichen Zielgebiets deuteten auf eine Nettoabnahme des Ziels hin. Das Nettowachstum des Inhibitorstamms wurde bei allen Behandlungen beobachtet.
Der Prozentsatz der Ausgangsfläche für den Inhibitorstamm war jedoch signifikant höher, wenn ein Wildtyp-Inhibitor unter überfüllten Bedingungen mit dem Ziel im Vergleich zu allen anderen Behandlungen koinubiert wurde. Um klare Bilder zu erhalten, muss das Agarose-Pad so flach wie möglich sein. Schneiden Sie Bandstücke, bevor Sie sie um den Dia wickeln, um sicherzustellen, dass sie die gleiche Länge haben.
