שיטה זו נועדה לכמת תחרות תלוית מגע באמצעות מערכת הפרשת סוג VI בין זני חיידקים ברמת התא הבודד. טכניקה זו משתמשת בשטח התא הכולל ולא בספירת תאים כדי לכמת תחרויות חיידקים, מה שמקל על חוקרים ללא גישה קניינית לתוכנת ניתוח תמונה. שיטה זו יכולה להשתנות בקלות כדי לכמת תחרות בין חיידקים מגוונים הניתנים לתחנות.
בנוסף, ניתן למטב את ההתקנה הניסיונית לשימוש במיקרוסקופים זקופים או הפוכים. ראשית, להכין את פתרון כרית אגרוז על ידי המסת 2% הפשרה נמוכה agarose לתוך PBS ימי. מחממים את התמיסה לזמן קצר במשך כ -30 שניות במיקרוגל ובמערבולת עד שהאגורוז מומס לחלוטין.
שמור על פתרון זה באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש. לאחר מכן, לעטוף חתיכת קלטת מעבדה סביב שקופית זכוכית חמש פעמים. גלישה חוזרת של סרט מדידה באותה שקופית, כך שהמרחק בין שתי חלקי הקלטת קטן במעט מרוחב הכיסוי.
כדי להבטיח משטח כרית אגרוז שטוח, תמיסת אגרוז חמה פיפטה בין שתי חתיכות הסרט ומיד לשים כיסוי על גבי כך כיסוי יוצר קשר עם הנוזל ודוחף החוצה את כל בועות בתמיסת agarose. תן כרית אגרוז להתמצץ בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן לחתוך כרית אגרוז זה עם סכין גילוח לארבעה רפידות 5 מילימטר מרובע לשמש להדמיה.
כדי להכין את הזנים לדגירה משותפת, פס החוצה כל זן מן המלאי קפוא על לוחות אגר LBS בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לדגורת לילה ב 24 מעלות צלזיוס. למחרת, לבחור שתי מושבות מכל זן ו resuspend המושבות באנטיביוטיקה בתוספת LBS בינוני. דגירה מושבות respended לילה ב 24 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סיבובים לדקה.
למחרת בבוקר, תת-תרבות כל ביולוגי לשכפל אחד לתוך 1, 000 פעמים בינוני LBS טרי ללא אנטיביוטיקה ודגרה עד התאים מגיעים לצפיפות אופטית של כ 1.5 ב 600 ננומטר. למדוד ולתעד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר עבור כל הדגימות. לנרמל כל מדגם לצפיפות אופטית של אחד על ידי דילול התרבות עם מדיום LBS.
מערבבים את שני הזנים המתחרים ביחס שווה על ידי הוספת 30 מיקרוליטרים של כל זן מנורמל לצינור 1.5 מיליליטר שכותרתו. מערבולת את תרבות המתח המעורבת למשך שנייה עד שתי שניות. מערבבים את הזנים המתחרים עבור כל שכפול ביולוגי וטיפול כדי ליצור בסך הכל ארבעה צינורות זנים מעורבים.
מרכז כל תרבית מעורבת פי שלושה על ידי צנטריפוגה כדי להבטיח תאים מתחרים צפופים מספיק להרג תלוי מגע במהלך דגירה משותפת. יש להשליך את הסופר-נט, להזרים כל גלולה ל-20 מיקרו-ליטרים של מדיום LBS ולבצע הליכי ריכוז עבור כל דגימה. אם הדמיה על מיקרוסקופ הפוך, התחילו באיתור שני מיקרוליטרים של תרבות מעורבת על החלק התחתון של צלחת פטרי באורך 35 מ"מ והנחו את כרית האגורוז מעל נקודת הדגירה המשותפת.
מניחים כיסוי זכוכית עגולה 12 מ"מ מעל כרית האגורוז. תצפית חוזרת והצבת כיסויים לשלוש התרבויות המעורבות הנותרות, מה שיביא לתמונה של ארבע מנות. לפני שתמשיך קדימה, תן לשקופיות לשבת על הספסל במשך כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב על כרית אגר כדי למנוע תנועה במהלך תהליך ההדמיה.
התחל על-ידי התמקדות בתאים המשתמשים ב- DIC כדי למזער אפקטי ליקונומיקה. בהתבסס על הגודל הממוצע של תא חיידקי יחיד, השתמש במטרה שמן 100X. התאם את זמן החשיפה ואת הגדרות הרכישה עבור כל ערוץ עם זיהוי רקע מינימלי.
בחר לפחות חמישה שדות תצוגה ורכוש תמונות בכל ערוץ מתאים. פתח את תוכנת ניתוח התמונה וייבוא קבצי התמונה לניתוח. המר את התמונה לגווני אפור, הפרד את הערוצים ולהתחיל על-ידי הוספת סף ויצירת מסיכה בינארית של התמונה המעובדת מראש.
בחרו 'נתח' ולאחר מכן מהתפריט הנפתח, בחרו 'קבע קנה מידה' והזן את הערכים המתאימים להגדרת המיקרוסקופיה. לאחר מכן, עבור אל הגדרת מדידות ובחר אזור. תחת הכרטיסיה ניתוח, בחר ניתוח חלקיקים באמצעות הגדרות ברירת המחדל.
אם קיימים פסולת במדגם, ניתן להתאים את הגודל או המעגליות כדי לסנן חלקיקים שאינם תאים. בחר הצג ולאחר מכן חלוקה לרמות כך שהפלט של ניתוח סינון החוצה יכלול חלוקה לרמות ממוספרת של כל החלקיקים שנותחו. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני לניתוח וגרף נוספים.
תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של כל טיפול ניסיוני מוצגות. ריכוז תרבית מעורבת לפני התצפית הביא לתאי יעד מעוגלים או נעלמים במשך שעתיים, מה שמצביע על עיכוב מוצלח. כאשר התרבות המעורבת אינה מרוכזת, התאים נשארים מפוזרים בשקופית.
ללא מגע מספיק בין תא לתא, זן המטרה אינו מעוכב על ידי הזן הקטלני. תאי המטרה לא נעלמו ולא התעגלו כאשר דוגר עם מוטציה T6SS בתנאים צפופים או מפוזרים. לפיכך, המטרה הייתה חסרת מעצורים באף אחד מהטיפולים.
תוצאות ניתוח החלקיקים גרפו ונותחו הן עבור זן היעד והן עבור זן המעכב. יותר מ-100% מאזור היעד ההתחלתי בנקודת הזמן הסופית מייצג עלייה נטו ביעד ונמוך מ-100% משטח היעד הראשוני הצביע על ירידה נטו ביעד. הצמיחה נטו של זן המדכא נצפתה בכל הטיפולים.
עם זאת, אחוז השטח הראשוני עבור זן המעכב היה גבוה משמעותית כאשר מעכב מסוג בר היה דוגר יחד עם היעד בתנאים צפופים בהשוואה לכל הטיפולים האחרים. כדי לקבל תמונות ברורות, כרית אגרוז צריך להיות שטוח ככל האפשר. גזור חתיכות סרט הדבקה לפני גלישתן סביב השקופית כדי לוודא שהן באותו אורך.
