Questo metodo è stato progettato per quantificare la competizione dipendente dal contatto attraverso il sistema di secrezione di tipo VI tra ceppi batterici a livello di singola cellula. Questa tecnica utilizza l'area cellulare totale piuttosto che il conteggio cellulare per quantificare le competizioni batteriche, rendendo facile per i ricercatori senza accesso al software di analisi delle immagini proprietario. Questo metodo può essere facilmente modificato per quantificare la concorrenza tra diversi microbi coltivabili.
Inoltre, la configurazione sperimentale può essere ottimizzata per l'uso su microscopi verticali o invertiti. Per cominciare, preparare la soluzione di tampone di agarose sciogliendo l'agarose a fusione bassa al 2% in PBS marino. Riscaldare brevemente la soluzione per circa 30 secondi nel microonde e vortice fino a quando l'agarose è completamente dissolto.
Conservare questa soluzione a bagnomaria a 55 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Quindi, avvolgere un pezzo di nastro da laboratorio attorno a un vetrino cinque volte. Ripetere l'avvolgimento del nastro sulla stessa diapositiva, in modo tale che la distanza tra i due pezzi di nastro sia leggermente inferiore alla larghezza del coperchio.
Per garantire una superficie piatta del tampone di agarose, pipettare la soluzione di agarose caldo tra i due pezzi di nastro e mettere immediatamente una copertura sulla parte superiore in modo che la slitta di copertura entra in contatto con il liquido e spinga fuori eventuali bolle nella soluzione di agarose. Lasciare che il tampone di agarose si solidifichi a temperatura ambiente per almeno un'ora. Quindi tagliare questo tampone di agarose con una lama di rasoio in quattro pad da 5 millimetri quadrati da utilizzare per l'imaging.
Per preparare i ceppi per la co-incubazione, strisciare ogni ceppo da scorte congelate sulle piastre di agar LBS integrate con gli antibiotici appropriati e incubare durante la notte a 24 gradi Celsius. Il giorno successivo, scegli due colonie da ciascun ceppo e riconsegre le colonie in un mezzo LBS integrato con antibiotici. Incubare colonie riconsospendite durante la notte a 24 gradi Celsius con agitazione a 200 rotazioni al minuto.
La mattina dopo, la sottocoltura biologica replica uno in 1.000 volte mezzo LBS fresco senza antibiotici e incuba fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,5 a 600 nanometri. Misurare e registrare la densità ottica a 600 nanometri per tutti i campioni. Normalizzare ogni campione ad una densità ottica di uno diluendo la coltura con il mezzo LBS.
Mescolare i due ceppi concorrenti in un rapporto uguale aggiungendo 30 microlitri di ciascun ceppo normalizzato a un tubo etichettato da 1,5 millilitri. Vortice della coltura mista per uno o due secondi. Mescolare i ceppi concorrenti per ogni replica biologica e trattamento per generare un totale di quattro tubi di ceppo misti.
Concentrare ogni coltura mista tre volte mediante centrifugazione per garantire cellule concorrenti sufficientemente dense per l'uccisione dipendente dal contatto durante la co-incubazione. Scartare il surnatante, ricaspenare ogni pellet in 20 microlitri di mezzo LBS ed eseguire procedure di concentrazione per ciascun campione. Se l'imaging su un microscopio invertito, iniziare individuando due microlitri di una coltura mista sul fondo di copertura numero 1,5 di una capsula di Petri da 35 millimetri e posizionare il tampone di agarose sopra il punto di co-incubazione.
Posizionare un coperchio circolare di vetro da 12 millimetri sopra il tampone di agarose. Ripeti l'individuazione e il posizionamento di coverslip per le restanti tre colture miste, il che si tradurrà in quattro piatti da immaginare. Prima di procedere, lasciare che le diapositive si siedano sul piano di lavoro per circa cinque minuti per consentire alle cellule di depositarsi sul tampone di agar per evitare movimenti durante il processo di imaging.
Inizia concentrandoti sulle celle usando DIC per ridurre al minimo gli effetti di fotosableaching. Sulla base delle dimensioni medie di una singola cellula batterica, utilizzare un obiettivo di olio 100X. Regola il tempo di esposizione e le impostazioni di acquisizione per ogni canale con un rilevamento minimo dello sfondo.
Selezionare almeno cinque campi di visualizzazione e acquisire immagini in ogni canale appropriato. Aprire il software di analisi delle immagini e importare i file immagine da analizzare. Converti l'immagine in scala di grigi, separa i canali e inizia con la soglia e la creazione di una maschera binaria dell'immagine pre-elaborata.
Selezionare Analizza, quindi dal menu a discesa, selezionare Imposta scala e immettere i valori appropriati per la configurazione della microscopia. Quindi, vai a imposta le misure e seleziona Area. Nella scheda Analizza selezionare Analizza particelle utilizzando le impostazioni predefinite.
Se i detriti sono presenti nel campione, la dimensione o la circolarità potrebbero essere regolate per filtrare le particelle non cellulari. Selezionare Mostra e quindi Contorni in modo che l'output dell'analisi di filtraggio includa un contorno numerato di tutte le particelle analizzate. Esporta le misurazioni in un software per fogli di calcolo per ulteriori analisi e grafici.
Vengono mostrate le immagini rappresentative di fluorescenza di ciascun trattamento sperimentale. La concentrazione della coltura mista prima dello spotting ha portato a cellule bersaglio arrotondate o scomparse nell'arco di due ore, indicando un'inibizione riuscita. Quando la coltura mista non è concentrata, le cellule rimangono disperse sul vetrino.
Senza un sufficiente contatto cellula-cellula, il ceppo bersaglio non è inibito dal ceppo letale. Le cellule bersaglio non sono scomparse né sono diventate arrotondate quando co-incubate con un mutante T6SS in condizioni affollate o disperse. Pertanto, l'obiettivo era disinibito in entrambi i trattamenti.
I risultati dell'analisi delle particelle sono stati rappresentati graficamente e analizzati sia per il ceppo bersaglio che per il ceppo inibitore. Maggiore del 100% dell'area target iniziale al punto temporale finale rappresenta un aumento netto dell'obiettivo e inferiore al 100% dell'area target iniziale indicata una diminuzione netta dell'obiettivo. La crescita netta del ceppo inibitore è stata osservata in tutti i trattamenti.
Tuttavia, la percentuale dell'area iniziale per il ceppo inibitore era significativamente più alta quando un inibitore wild-type è stato co-incubato con il bersaglio in condizioni affollate rispetto a tutti gli altri trattamenti. Per ottenere immagini chiare, il pad di agarose deve essere il più piatto possibile. Tagliare i pezzi di nastro prima di avvolgerli attorno alla diapositiva per assicurarsi che siano della stessa lunghezza.
