この方法は、単一細胞レベルで細菌株間のVI型分泌系を介して接触依存性の競争を定量化するように設計された。この技術は、細胞数ではなく総細胞面積を使用して細菌の競争を定量化し、独自の画像解析ソフトウェアにアクセスできない研究者にとって容易です。この方法は、多様な可分泌性微生物間の競争を定量化するために容易に変更することができる。
さらに、実験のセットアップは直立または逆の顕微鏡の使用のために最大限に活用することができる。まず、2%低溶融アガロースを海洋PBSに溶解してアガロースパッド溶液を調製する。溶液を電子レンジと渦で約30秒間短時間加熱し、アガロースが完全に溶解するまで加熱します。
この溶液を55°Cの水浴で使用する準備ができるまで保管してください。次に、ラボテープをガラススライドの周りに5回巻きます。2 つのテープピース間の距離がカバースリップ幅よりわずかに小さくなるような、同じスライド上でテープのラッピングを繰り返します。
平らなアガロースパッド表面を確保するために、ピペットはテープの2つの部分の間にアガロース溶液を温め、カバースリップが液体と接触し、アガロース溶液内の気泡を押し出すようなカバースリップを直ちに上に置きます。アガロースパッドを室温で少なくとも1時間固めます。次に、このアガロースパッドをカミソリの刃で4つの5平方ミリメートルのパッドに切り、イメージングに使用します。
共培養のための株を準備するには、適切な抗生物質を補ったLBS寒天プレートに冷凍株から各株をストリークアウトし、摂氏24度で一晩インキュベートする。翌日、各株から2つのコロニーを選び、抗生物質補充LBS培地でコロニーを再中断する。1分間に200回転で揺れ、摂氏24度で一晩再懸濁したコロニーをインキュベートする。
翌朝、各生物学的に1つを抗生物質なしで1,000倍の新鮮なLBS培地に複製し、細胞が600ナノメートルで約1.5の光学密度に達するまでインキュベートする。すべてのサンプルの600ナノメートルで光学密度を測定し、記録します。各サンプルをLBS培地で培養して1つの光学密度に正規化します。
2つの競合株を等しい比率で混合し、各正規化された株の30マイクロリットルをラベル付けされた1.5ミリリットルチューブに加えます。1〜2秒間混合歪み培養を渦巻く。各生物学的複製と処理のために競合株を混合し、合計4つの混合株チューブを生成します。
各混合培養物を遠心分離により3倍に濃縮し、共培養時の接触依存性殺死のために十分に密な競合細胞を確保する。上清を捨て、各ペレットを20マイクロリットルのLBS培地で再懸濁し、各サンプルの濃縮手順を行う。逆顕微鏡でイメージングする場合は、混合培養の2マイクロリットルを35ミリメートルペトリ皿の1.5カバースリップ底に見つけ、アガロースパッドを共培養スポットの上に置きます。
アガロースパッドの上に12ミリメートルの円形のガラスカバースリップを置きます。残りの3つの混合培養物に対してカバースリップのスポッティングと配置を繰り返し、4つの料理を画像化します。先に進む前に、スライドをベンチトップに約5分間座らせて、細胞が寒天パッドに落ち着いてイメージングプロセス中の動きを避けるようにします。
まず、DICを使用して細胞に焦点を当て、光の漂白効果を最小限に抑えます。1つの細菌細胞の平均サイズに基づいて、100Xの油性目的を使用する。最小限のバックグラウンド検出で各チャンネルの露出時間と取得設定を調整します。
少なくとも5つの視野を選択し、適切なチャンネルごとに画像を取得します。画像解析ソフトウェアを開き、解析するイメージ ファイルをインポートします。画像をグレースケールに変換し、チャンネルを分離し、事前処理された画像のバイナリマスクをしきい値にして作成します。
[分析]を選択し、ドロップダウンメニューから[スケールを設定]を選択し、顕微鏡の設定に適切な値を入力します。次に、測定値を設定し、[面積]を選択します。[解析]タブで、デフォルト設定を使用してパーティクルを解析を選択します。
サンプルに破片が存在する場合、サイズまたは円形度を調整して非細胞粒子を除外することができます。フィルターアウト分析の出力に、分析されたすべてのパーティクルの番号付きアウトラインが含まれるように、[表示]を選択してから[アウトライン]を選択します。さらに分析とグラフ作成を行う際に、測定値をスプレッドシート・ソフトウェアにエクスポートします。
各実験治療の代表的な蛍光画像を示す。スポッティング前に混合培養を濃縮すると、2時間にわたって丸みを帯びたまたは消失した標的細胞が生じ、阻害に成功したことを示す。混合培養が濃縮されない場合、細胞はスライド上に分散したままである。
十分な細胞間接触がなければ、標的株は致死性株によって阻害されない。標的細胞は、T6SS変異体と混入または分散した状態で共培養しても、消失も丸みもない。したがって、標的はいずれの処置でも抑制されなかった。
粒子分析結果をグラフ化し、標的株と阻害剤株の両方について分析した。最終時点での初期目標領域の100%を超えると、目標の純増加を表し、初期目標領域の100%未満は目標の純減少を示した。阻害剤株の純成長は、すべての治療にわたって観察された。
しかし、野生型阻害剤が他のすべての治療法と比較して混雑した状態で標的と共培養された場合、阻害剤株の初期領域の割合は有意に高かった。鮮明な画像を得るためには、アガロースパッドはできるだけ平らである必要があります。テープピースをスライドの周りに巻き付ける前に切って、同じ長さになるようにします。
