Эта процедура очень чувствительна и позволяет визуализировать несколько расшифровок с минимальным фоном. Этот метод может генерировать точные карты транскрипционного профиля высоко гетерогенных типов клеток. Демонстрировать процедуру будут я и Джонсон Боб-Мануэль, техник-исследователь в лаборатории.
Начните с сбора всей вагусной ганглионной массы от восьминедельной мыши с каждой стороны, с помощью рассекающего прицела и хирургических инструментов. После обезглавливания мыши используйте небольшие щипцы, чтобы удалить грудиногиоидные и омогиоидные мышцы, расположенные сбоку от трахеи, чтобы обнажить затылочную кость. Очистите всю область мышц и тканей до тех пор, пока не будут видны сонная артерия, блуждающий и подъязычный нерв и большое отверстие.
Затем перережьте весь подъязычный нерв небольшими пружинными ножницами. Расположите узелковый ганглий в виде полупрозрачной массы, близкой к большому отверстию. Используя небольшие ножницы, аккуратно разбейте затылочную кость.
Чтобы обнажить яремный ганглий дальше, расположите черные меланоциты на поверхности яремного столба в качестве визуального ориентира. Когда ганглии обнаружены, перережьте нервные прикрепления между вагусной ганглионной массой и осторожно потяните за периферический конец блуждающего нерва, одновременно разрезая яремный ганглий к стволу мозга небольшими пружинными ножницами для извлечения всей ганглионной массы. Удалите соединительную ткань, ганглионную массу и жир, прилипший к блуждающему нерву.
Сохранение примерно полусантиметра блуждающего нерва для облегчения обработки и локализации образцов. Поместите удаление в ганглии с помощью тонких щипцов в 1,5-миллиметровые микроцентрифужные трубки. И инкубировать при четырех градусах Цельсия в формалине в течение 24 часов.
А затем с 30% сахарозой в течение 24 часов. После инкубации расположите ганглии внутри капли диаметром четыре миллиметра оптимальной температуры режущей среды на куске алюминиевой фольги. И фраза образца на ложе сухого льда.
Разрезайте замороженные образцы с помощью криостата на участки толщиной 14 микрометров при минус 20 градусах Цельсия и соберите разрезанные участки на предметных стеклах микроскопа в виде трех серий на расстоянии 42 микрометров друг от друга. Промойте слайды срезами тканей в PBS. И выпекать 30 минут при температуре 60 градусов Цельсия в духовке для выпечки.
Затем постфиксируйте слайды в 4%-ном формалине в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Последовательно обезвоживайте слайды в 50%70% и 100% этаноле в течение пяти минут каждый. И нанесите раствор перекиси водорода на образцы в течение 10 минут перед промывкой в двойной дистиллированной воде.
Для гибридизации In situ, или ISH, обработайте образцы целевым реагентом извлечения в течение пяти минут. Затем последовательно промывайте образцы в двойной дистиллированной воде и 100% этаноле с последующей сушкой на воздухе. Используя гидрофобную ручку, создайте барьер вокруг образцов.
В то время как образцы обрабатываются протеазой в течение 30 минут при 40 градусах Цельсия и печью гибридизации, предварительно разогрейте зонды при 40 градусах Цельсия и охладите их при комнатной температуре перед использованием. После выхода из духовки инкубируйте слайды с нужной комбинацией целевых зондов в течение двух часов при 40 градусах Цельсия в гибридизационной печи. Инкубируйте отрицательную контрольную ткань с дигидродипиколинатредуктазой или DapB, мишенью зонда C1 в течение двух часов при 40 градусах Цельсия.
Промойте слайды в буфере для стирки и храните в пятикратном физиологическом растворе цитрат натрия при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день промыть горки промывочным буфером перед инкубацией с амплификационными реагентами. И лечить канальными специфическими реагентами, как описано в рукописи.
Вымойте слайды с последующей обработкой DapB в течение 30 секунд. Затем сразу же нанесите монтажную среду на каждый слайд и поместите крышку на участок ткани. Держите ткани горизонтально в держателе слайда при четырех градусах Цельсия до получения изображения.
Подготовьте конфокальный микроскоп для визуализации, установив необходимые параметры. Получайте изображения с усреднением линий четыре и размером пикселя не менее 1024 на 1024 для улучшения качества изображений. Убедившись в параметрах получения, начните получать изображения, используя те же настройки.
Приписывайте ложные цвета каждому каналу для облегчения визуализации. Используя цифровые изображения, выполните подсчет клеток, идентифицируя контур положительных профилей области РНК с одним ядром, слегка окрашенным DapB. Рассчитайте процент положительных профилей области РНК, выражающих каждую расшифровку.
Оптимальные параметры сбора были выбраны для каждого лазера на основе неспецифической флуоресценции, полученной в отрицательной контрольной ткани. Эндогенная флуоресценция в узловом ганглии молодой взрослой мыши минимальна. И инкубация с помощью зонда DapB не привела к сигналам.
При повышенной мощности лазера и усилении с 488-нанометровым лазером появляются нежелательные фоновые и случайные флуоресцентные точки. Метод РНК-скопа был применен для обнаружения трех генов в тканевых участках вагусной ганглионной массы. Профиль тканей был положительным для GHSR и CCK1R.
Профиль включал транскрипты Phox2b и CCK1R в ростральной части узелкового ганглия. В результате мультиплекса ISH в узловых афферентных нейронах сигналы Phox2b специфически накапливались в афферентных нейронах, расположенных в узловом ганглии. Сигналы CCK1R интенсивно мечили многие нейроны в узловом ганглии.
При низком увеличении клетки, экспрессирующие низкие сигналы CCK1R или GSHR, не могли легко наблюдаться. DapB помог визуализировать ткань и идентифицировать вагусные афферентные нейроны с большим и слегка окрашенным ядром. При большом увеличении положительные профили Phox2b очевидны.
Второй и третий профили представляют собой ячейки Phox2b с высокими и умеренными сигналами CCK1R. Четвертый профиль выражал как GHSR, так и CCK1R. В результате мультиплексного ISH яремных афферентных нейронов транскрипт PRDM12 можно было увидеть специфически накопленным в афферентных нейронах, расположенных в яремном ганглии.
При большом увеличении умеренные сигналы для CCK1R были обнаружены в профилях один и два. Третий профиль является представителем клеток PRDM12, отрицательных для CCK1R или GHSR. Консистенция рассечения является важным фактором.
Не менее важно убедиться, что параметры получения изображений не генерируют нежелательные фоновые сигналы. Мультиплексная гибридизация In situ стала золотым стандартом в молекулярных установках, особенно в области нейроанатомии. Этот метод можно легко сочетать с иммуногистохимией.
