Этот протокол представляет собой метод живого изображения, сборки обонятельной цепи на уровне одного аксона от развивающегося мозга. Рассечение для очистки тканей, покрывающих развивающийся мозг, позволяет собирать высококачественные изображения из внутреннего мозга. Этот метод дает ценную информацию о клеточной биологической основе развития схемы.
Его можно легко модифицировать для изучения развития других схем. Человеку требуется некоторое время, чтобы выполнить стабильное ручное управление в микродиссекции. Больше практики будет полезно.
Для начала подготовьте чашку для культуры для мобилизации экспланта во время покадровой визуализации, положив Сильварда толщиной 0,5 сантиметра на нижнюю поверхность чашки Петри и дав ей затвердеть в течение 48 часов при комнатной температуре. Чтобы подготовить микроштифты для иммобилизации экспланта на этой пластине с помощью щипцов, наклейте несколько микроштифтов на ленту с острыми концами, выровненными с одной стороны, и вырежьте ножницами два миллиметра острых концов. Затем, используя щипцы, вставьте вырезанные микроштифты в слой Sylgard готовой пластины Sylgard.
С помощью щетки соберите белых куколок, которые образуют пупариум в течение одного часа и перенесите их в новый флакон. Высиживайте куколок на водяной бане, закаленной при 37 градусах Цельсия, в течение 40 минут, чтобы вызвать редкие клоны ORN из случайных типов. После теплового шока поместите флакон при 25 градусах Цельсия в течение 30 часов, в результате чего куколки выдержатся через 30 часов после образования пупария.
Затем подготовьте питательную среду для эксплантации, как описано в тексте рукописи, и храните при четырех градусах Цельсия. В день визуализации добавьте фетальную бычью сыворотку, раствор человеческого инсулина и 20 растворов гидроксиэкдизона, растворенных в этаноле, во флакон объемом 50 миллилитров, содержащий 45 миллилитров среды дрозофилы Шнайдера. Хорошо перемешайте и переложите 15 миллилитров полной среды в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров и храните остальную часть полной среды при четырех градусах Цельсия в течение недели.
Затем накройте отверстие трубок, содержащих полную среду, парафиновой пленкой и насытите среду кислородом, прокачивая пузырьки кислорода под поверхность жидкости через стерильный пятимиллилитровой наконечник пипетки со скоростью один пузырь в секунду в течение 20-30 минут. Далее стерилизуем поверхность вскрытия скважины и предварительно подготовленную пластину Сильварда 70% этанолом и дайте им высохнуть перед использованием. С помощью щетки перенести 30 часов АПФ куколки на папиросную бумагу для высыхания внешней поверхности куколки в течение пяти минут.
После нанесения двусторонней ленты на стеклянную горку, аккуратно прикрепите высушенную куколку к липкой поверхности ленты спинной стороной, обращенной вверх. Осторожно прижмите куколку щеткой, чтобы правильно прикрепить вентральную сторону к ленте, не повредив куколку. Вставьте один острый кончик щипцов между коричневым футляром куколки и куколкой с боковой стороны и аккуратно разбейте коричневый футляр куколки через линию к заднему концу куколки.
Как только коричневый корпус куколки будет открыт, используя щипцы, осторожно удерживайте куколку и перенесите ее в рассечение, содержащее один миллилитр насыщенной кислородом полной среды. Погрузите куколку в среду для погружения ее на дно колодца. Чтобы рассечь антенну мозга эксплантировать из куколки, осторожно удерживайте куколку с помощью щипцов одной рукой и, используя пару микросублиц, создайте небольшое отверстие с задней стороны куколки, которое выпускает высокое давление внутри куколки.
Начиная с отверстия, прорежьте вентральную среднюю линию до шеи, затем прорежьте окружность шеи, чтобы отделить голову от тела куколки и поместить тело в другой колодец. Затем вырежьте прозрачную кутикулу, покрывающую дорсальную сторону мозга, чтобы обнажить жировое тело на вершине мозга, обеспечив сохранение кутикулы, к которой прикрепляются сетчатка и антенна, и аналогичным образом, отрежьте кутикулу от вентральной стороны мозга. Пипетка — среда к открытым областям на спинной и вентральной сторонах головы, используя пипетку P10, чтобы осторожно вымыть жировое тело, покрывающее мозг и антенну.
Чтобы изучить взаимодействие двусторонних аксонов ORN или аксонов ORN с PN-дендрритным нацеливанием, разорвите антеннальный нерв во время стадии, аккуратно разместив лопасти микросублиц между кутикулой и мозгом и разрежьте заинтересованный антеннальный нерв. Для переноса рассеченного эксплантата на пластину Сильварда поместите примерно 200 микролитров капли насыщенной кислородом полной среды на поверхность Сильварда. Пипетка жирового тела, полученная из рассеченного ствола несколько раз через 200 микролитровый наконечник пипетки для покрытия внутренней поверхности, чтобы предотвратить прилипание эксплантов к кончику пипетки во время переноса из рассеченного колодца в среднюю каплю на пластине Сильварда.
Используйте щипцы, чтобы закрепить эксплант на слое Сильварда в двух оптических долях, затем осторожно расположите пластину Сильварда на станции визуализации, обездвижите пластину с помощью лент и медленно добавьте 10 миллилитров насыщенной кислородом полной среды к пластине Сильварда с помощью пипетки P1000. Аксоны ORN прибывают в антенную долю между 18 часами и 36 часами APF, а затем перемещаются по антенной доле, пересекают среднюю линию и внедряют инновации в клубочки. До регистрации аксоны демонстрировали некоторый боковой дрейф по мере развития мозга, и после регистрации дрейф был исправлен.
Клубочковые идентичности извлеченных аксонов ORN были выявлены путем иммуноокрашения маркера нейропила и кадгерина. Сравнивая с картой внутренних долей, можно определить идентичность каждого клубочка. Во время посева ex vivo рост бактерий обычно вызывает отдохнувшее развитие обонятельного контура.
Поэтому важно тщательно стерилизовать культурную тарелку и булавки перед визуализацией и держать комнату визуализации чистой и изолированной. Для достижения более высокого пространственного временного разрешения эта эксплантная система может быть визуализирована с помощью более продвинутого микроскопа, адаптивного решетчатого светового микроскопа. Хотя разработка заводской схемы была показана здесь в качестве примера, эта система потенциально может быть расширена для изучения других схем и процессов развития в развивающемся центральном мозге.
