Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным инструментом для функционального генетического анализа в Anopheles gambiae посредством генетической модификации экспрессии генов пространственно-временным контролируемым образом. Бинарная система обеспечивает гибкость экспериментальных подходов к фенотипической характеристике экспрессии трансгенов, даже если вызваны серьезные затраты на приспособленность. Эта система может быть использована для фенотипической характеристики генов, потенциально участвующих в резистентности к инсектицидам, передаче патогенов или тех, которые используются в методах генетического контроля.
Фрейзер Коулман, техник-исследователь, поможет продемонстрировать эту процедуру Начните со сбора куколок с помощью трехмиллилитровой пластиковой пипетки Пастера с отрезанным концом на прозрачной плоской тарелке, подходящей для использования со стереомикроскопом. Осторожно удалите большую часть воды вокруг куколок. Включите люминесцентную лампу и дайте ей прогреться.
Рассмотрим цветовые пространственно-временные паттерны выражения и соотношения различных фенотипов, которые ожидаются при скрининге на флуоресцентный маркер. Выберите необходимый фильтр на флуоресцентном стереоскопе и убедитесь, что виден цветной луч света, направленный в центр сценической пластины. Под белым светом центрируйте куколки в поле зрения и сосредоточьте их.
Выключите белый свет и используйте тонкий фокус, чтобы сфокусировать область куколок, несущих интересующий фенотип с видимым флуоресцентным рисунком. Используйте кисть с мелкими деталями, чтобы аккуратно повернуть куколок и переместить анальные весла, чтобы можно было идентифицировать наружные гениталии. Отдельные куколки на основе отличительных наружных гениталий.
Самцы имеют длинную трубку, которая выдавливается из конечного дорсального сегмента примерно половины длины анальных лопастей. Наружные половые органы самок куколок значительно короче и раздвоены. Разделите полых куколок на группы по 10 или менее в прозрачных 20-миллилитровых трубках с водой и запечатайте трубки клубком из ваты.
Аспирируйте нужное количество взрослых самцов и самок из трубок в клетку или небольшое ведро, заботясь о том, чтобы не повредить взрослых во время этой передачи. Поддерживайте крест в течение пяти-семи дней перед кровоснабжением. На следующий день можно собирать яйцеклетки для изучения развития эмбриона.
Соберите камеру яйцекладки и осторожно введите в нее от 10 до 15 кормленых кровью самок. Накройте камеру яйцекладки и оставьте на 20 минут. Осторожно отсоедините 50-миллилитровую полипропиленовую трубку от горшка с яйцекладкой, следя за тем, чтобы комары не выпустили.
Накройте кастрюлю и дайте яйцам созреть до интересующей стадии развития. Соберите яйца из горшка, используя кисть с мелкими деталями, и поместите их на воду в выкопанный стеклянный блок площадью 40 квадратных миллиметров. Аккуратно извлеките воду из стеклянного блока с помощью микропипетки и накройте яйца 500 микролитрами FAA.
Осторожно осциллируйте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут. Тщательно промойте яйца 15 раз дистиллированной водой, чтобы удалить все следы раствора FAA. Используя 1000-микролитровый микропипетку, добавьте, а затем удалите один миллилитр дистиллированной воды за раз, заботясь о том, чтобы не повредить яйца при этом.
Залейте неподвижные яйца одним миллилитром раствора Trpis и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Яйца начнут развивать бледные пятна после пяти минут инкубации, в конечном итоге достигнув молочно-белого цвета после очистки. Тщательно промойте яйца 15 раз дистиллированной водой, чтобы удалить все следы раствора Trpis.
Экспрессия флуоресцентных маркеров, приводимых в действие промотором 3xP3, наблюдается в глазах и вентральных ганглиях куколок Anopheles gambiae. Использование различных цветных флуоресцентных маркеров позволяет выбирать и отсеивать модифицированных людей, несущих различные компоненты GAL4 и UAS. При работе с двусторонней системой GAL4-UAS необходимо скрещивать самцов и самок из разных штаммов для приобретения потомства, несущего как компоненты GAL4, так и UAS.
Для сексинга используется дифференциальная морфология, наблюдаемая у мужских и женских наружных половых органов куколок. Здесь приведен пример неидентифицируемой куколки. Удаление всей воды из куколок, как показано справа, увеличивает сложность сексинга, так как анальные весла затемняют визуализацию гениталий.
Двусторонняя система GAL4-UAS позволяет модифицировать экспрессию генов контролируемым пространственно-временным образом. Это можно визуализировать, скрещивая эноцит и вездесущие GAL4 четыре экспрессирующие линии драйвера с линией ответчика UAS-mCherry. Ключевым преимуществом использования двусторонней системы GAL4-UAS является легкость изучения летальных фенотипов даже на эмбриональной стадии.
Для этого необходимо визуализировать внутреннюю морфологию эмбрионов. Нормальные морфологические характеристики, наблюдаемые на разных стадиях эмбрионального развития через 12, 24 и 36 часов после укладки, можно увидеть после завершения протокола очистки эмбриона. На протяжении всей этой процедуры жизненно важно, чтобы куколкам и яйцам не позволяли высыхать.
Поэтому важно работать быстро при удалении жидкостей. Метод GAL4-UAS позволил нам функционально охарактеризовать гены, участвующие в резистентности к инсектицидам, и гены, которые потенциально используются в методах контроля генного драйва.
