Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспроизводства. И эндокринология. И применимы к изучению синдрома поликистозных яичников или СПКЯ и гиперандрогенизма.
Преимущество этой техники в том, что она облегчает последовательное, равномерное, долгосрочное высвобождение гормонов дорогостоящим эффективным способом. JHUs лечения процедуры будет Пинг Сюэ, техник из моей лаборатории. Для приготовления дигидротестостерона или гранул DHT используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать 15-миллиметровый кусок силиконовой трубки.
И использовать три миллилитров шприц оснащен притупленной иглой 20 калибровочных вводить от двух до пяти миллиметров медицинского клеевого силикона в один конец трубки. Разрешить трубки высохнуть на ночь. И проверьте наличие пузырьков воздуха на герметичном конце.
Ношение соответствующего средства индивидуальной защиты залить DHT порошок в пластиковый катер в flowhood. Впечатлите открытый конец клея с ограниченной трубкой в порошок. Используя большую выпрямленную скрепку, прикармляйте порошок вниз в трубы, пока DHT не достигнет соответствующей экспериментальной глубины.
Затем запечатать открытую сторону трубки с силиконом на ночь. На следующее утро, сократить каждую запечатанную сторону, чтобы получить два миллиметра длины силикона по обе стороны от DHT и не DHT контроль гранул. Затем храните гранулы в 50-миллилитровой конической трубке, завернутой фольгой при комнатной температуре до трех месяцев.
Для СПКЯ мыши модель поколения equilibrate до 20 DHT или управления гранулы в отдельных 50 миллилитров конических труб, содержащих 30 миллилитров 0,9 процента солевого раствора в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, подтвердить отсутствие реакции на боль в крайнем случае в анестезированной двухмесячной самки мыши и использовать стерильную марлю для администрирования последовательного Povidone-йода и 70 процентов этинола скрабы в хирургической области. Затем сделайте пятимиллиметровый разрез через кожу возле шеи.
И используйте десятиколейный трокар, чтобы сделать 15-миллиметровый туннель в ростральном направлении. Используйте трокар, чтобы вставить гранулы dorsally в туннель и запечатать разрез с хирургическим клеем. Вручную приближенные края раны с помощью типсов и использовать нежные мазки щеткой, чтобы применить три тонких слоя пленки жидкого клея на один сантиметр с каждой стороны противоположных краев раны.
Затем поместите мышь в одиночку в клетку на тепловой панели с мониторингом до полного лежачих. Замена гранул каждые четыре недели для поддержания постоянного уровня воздействия андрогенов. Через три дня после вставки гранул используйте р10 пипетку, чтобы впрыскивать десять микролитров стерильного солевого раствора в вагинальную полость и использовать наконечник пипетки, чтобы немедленно восстановить солевой раствор.
Распространение вагинальной клетки солевой образец на помечены слайд. И дайте солевого раствора высохнуть при комнатной температуре. Зафиксните высушенные горки в контейнере на 100 процентов этинола, по крайней мере пять минут.
Затем пятно слайды в течение одной минуты каждый в буфер B и буфер C от dif-быстрый окрашивания комплекта. В конце инкубации буфера C мыть горки с водопроводной водой в течение трех секунд и высушить их при комнатной температуре. Для определения прямой цикличности просмотрите слайды под десятикратной целью светового микроскопа.
Подсчитайте дни на каждом этапе и разделите их на общее количество дней для расчета процентного времени на каждом этапе. Чтобы проверить толерантность к глюкозе, 20 дней DHT вставки, быстро мышей на ночь. Взвесьте мышей на следующее утро, и использовать глюкометр и тест-полоски для измерения уровня глюкозы базилика в крови хвостовой вены.
Ввишать мышей с двумя граммами на килограмм массы тела 20 процентов декстрозы. Затем измерьте уровень глюкозы в образцах крови хвостовых вен на 15, 30, 60, 90, 120 минут после введения декстрозы. Чтобы приобрести потомство женщины от DHT вставленных дам, переместить самку мыши для тестирования в клетке с проверенным плодородным самцом в день 15, после вставки гранул.
Документ дамы вес тела каждую неделю, чтобы определить, если мышь беременна. На послеродовой день семь, окунуть стрельчатый наконечник в тату пасты и пометить каждого щенка с татуировкой на ноке. Взвешивание отмеченных мышей каждые семь дней до 70 дней.
Между послеродовой датой от 12 до 16, ухо удар мышей, чтобы про номер их в соответствии с системой, как показано на рисунке. Чтобы отличить пол, изучите вентраловую сторону каждой помеченной мыши. Самки будут иметь видимые соски.
Для сбора образцов крови для различных анализов вниз по течению использовать ланцет для сбора приблизительного экспериментального объема крови между девятью и десятью утра подменяных кровотечений вен. И центрифуга образцов, чтобы позволить сбор сыворотки. Затем храните образцы сывороток в 1,5 миллилитровых микро-центрифуговых трубках при температуре минус 80 градусов по Цельсию до их анализа.
Чтобы оценить половое созревание у потомства женщин dHT, каждый день после отевания в послеродовой день 21, проверьте вагинальное отверстие путем визуального осмотра. И использовать калибры для измерения ано-генитального расстояния. Хотя абсолютные значения сыворотки DHT отличаются между масс-спектрометрией и анализом Элизы, относительная народная смена DHT по сравнению с вставкой no-DHT аналогична как от анализа, так и от экспериментов.
Уровни DHT значительно увеличены от pre-зачатия через стельность в обоих мышах DHT и никаком DHT. Тем не менее, уровни DHT в два раза выше у мышей DHT по сравнению с не DHT мышей как до зачатия и гестационных точек времени. Взрослые дочери DHT проявляют различия в репродуктивной функции.
Например, нарушена eestrous цикличность по сравнению со взрослыми не DHT дочерей испытывают значительно больше раз в metestrus diestrus и меньше времени в про-эстерозных и эстерозных. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы инкубировать гранулы в течение 24 часов, прежде чем они используются для равномерного высвобождения гормона. После этой процедуры, репродуктивные и метаболические последствия воздействия DHT также могут быть изучены.
После его развития, эта техника проложила путь для исследователей в области эндрохронологии и материнского взаимодействия плода для изучения СПКЯ и воздействия гиперандрогенизма низкого уровня у самок мышей. Не забывайте, что работа с DHT может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как ношение перчаток и маски и очков, и работа в био-безопасности капюшон, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
