Hazırlanan tek hücreli süspansiyonun kalitesi, herhangi bir tek hücreli omik metodolojisi için yüksek kaliteli ve güvenilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Ve bu protokol size hücreleri çok zorlu dokulardan bile hızlı, nazikçe ve sağlam bir şekilde nasıl izole edeceğinizi gösterecektir. Bu protokolün en büyük avantajı, mükemmel kalitede kısa sürede çok sayıda numuneden doku ayrışması ve hücrelerin izolasyonunu sağlayan aerodinamik doku işlemedir.
Bu yöntem fare ve insan dişleri için geliştirilmiş olmasına rağmen, kıkırdak, kemik veya yoğun bağ dokusu da dahil olmak üzere hücre dışı matris bakımından zengin diğer dokular için de uygulanabilir. Diş posalarını insan ve özellikle fare dişlerinden izole etme prosedürü manuel olarak zordur. Gerçek deneyler başlamadan önce herkese bunu test etmesini tavsiye ediyoruz.
Başlamak için, ötenazili fareyi başının ventral yönüne bakarak başının arkasında tutun, böylece kuyruk uzağa işaret edilir. Küçük ve keskin makası kullanarak, mandibular kemeri, mandibulaların her yarısı arasındaki yumuşak dokuyu ve bitişik yüz kaslarını ortaya çıkarmak için cildi mandibuladan hızla çıkarın. Mandibulanın her iki tarafından derin bir kesim yapmak için, önce maserden mandibulanın buklasal tarafı boyunca temporomandibular bağlantıya kadar kesin ve daha sonra mandibulanın her yarısının iç kısmı boyunca ağız boşluğunun tabanından kesin.
Mandibula boyunca temporomandibuler ekleme kadar tüm kasları ve bağları ağız boşluğunun hem dışından hem de içinden kesin. Bükülmüş uç cımbızı kullanarak mandibulayı kavrayın ve çıkarın. Sonra makasla, parçalanmış mandibular senfoniyi ikiye bölmek için mandibuler senfoniyi kesin.
Mandibulanın her yarısından kalan yumuşak dokuyu chafe etmek için endüstriyel bir düşük tiftik mendili kullanın. Mandibulanın her iki kısmı temizlendikten sonra, buz gibi HBSS ile önceden hazırlanmış bir Petri kabına yerleştirin. Mandibular kesici dişlerin diseksiyonu için, alveolar sırtın üç azı dişiyle de çıkarılması ve mandibular kemerin birinci ve ikinci azı dişi arasındaki konuma karşılık gelen yerde enine şekilde çatlatılması.
Kesici diş soketinin geri kalanından dikkatlice çekin. Gerekirse, kesici cımbız ve neşter ile kesici dişe bağlı kalan kemik parçalarını çıkarın. Parçalanmış kesici dişleri taze buz gibi HBSS'ye yerleştirin.
İlgi dokusunu parçaladıktan sonra, parçalanmış yumuşak dokuyu buz üzerinde tutulan 10 santimetrelik petri kabının ortasında taze buz gibi bir HBSS damlasına yerleştirin. Yuvarlak şekilli 10 numaralı neşter bıçağı kullanarak, dokuyu mümkün olan en küçük parçalara bölün. Damlacık ortasındaki doku parçalarını yeniden bir araya getirdikten sonra, doku agregalarını aynı neşter bıçağıyla tekrar tekrar kesin ve malzeme yeterince kıyılana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Bir mililitre pipet ucu kullanarak parçalanmış doku parçalarını önceden hazırlanmış bir sindirim karışımına aktarın. Daha sonra tüpü 60 derecelik bir açıyla yerleştirin ve tüpün içinde sürekli süspansiyon hareketleri sağlamak ve 15 ila 20 dakika kuluçkaya yatmak için hızı 150 ila 200 RPM'ye ayarlayın. Kuluçka sırasında her üç ila dört dakikada bir, tüm kümeleri parçalamak için bir mililitre pipet ucu kullanarak süspansiyonu kuvvetlice titratlayın.
Kuluçkanın sonunda, hücre süspansiyonunu son kez titrat ettikten sonra, 12 mililitrelik son hacme yavaşça buz gibi yıkama çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonu 300 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve ardından 10 mililitrelik serolojik pipetle süpernatantı dikkatlice çıkarın. Mikroliter başına 700 ila 1.200 hücrelik son konsantrasyonu elde etmek için peletin yıkama çözeltisine yeniden kullanın.
Kalan kümeleri veya kireçlenmiş doku parçalarını çıkarmak için hücre süspansiyonunu 50 mikrometre hücre süzgecinden geçirin ve tüpü daha fazla işleme kadar buzda tutun. Daha sonra floresan olarak aktive edilmiş hücre sıralama için hücreleri hazırlanmış bir tüpe yükleyin. Tüpü hücre sıralayıcısına yükleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi hücre kalıntılarını, çiftleri ve ölü hücreleri kaldırmak için sıkı bir gating stratejisi ayarlayın.
İlk olarak, cd45 antikor boyama ve sonraki FACS analizi son tek hücreli süspansiyondaki bağışıklık hücrelerinin sayısını netleştirmek için kullanıldı. Ücretsiz bir yöntem olarak, tek hücreli RNA dizileme verilerindeki toplam CD45 pozitif immün hücre sayısı analiz edildi. FACS kullanılarak %14.44 CD45 pozitif hücre tespit edildi.
Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizi, CD45 ifade eden hücrelerin% 10,9'unu gösterdi ve tek hücreli RNA dizileme verilerindeki hücrelerin azalması, sıralama analizi sırasında ek eşiklenmeden kaynaklanabilir. Önemli şeyler hızlı olmak ve mümkün olduğunda bu dokuyu veya hücreleri buzda tutmaktır. İzole hücrelerin sayısı özellikle fare azı dişi izolasyonu sırasında çok düşük olabilir.
Hücre kaybından kaçının. Tek hücreli izolasyon süresinin azaltılması, tüm tek hücreli deneylerin başarısı için çok önemlidir. Ve bu özel yöntem gerçekten bu süreyi azaltmaya ve fare ve insan sistemleri için yüksek kaliteli diş hücresi tipinin önünü açmasına izin verildi.
