Этот протокол важен, потому что он демонстрирует метод центральной черепно-мозговой травмы, который запускает нейрогенез у взрослых при дрозофиле, где обычно его нет. Мы ожидаем, что использование этой техники для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенеза взрослых, будет иметь отношение к регенерации нейронов человека. Изучение этой техники требует терпения и настойчивости.
Мы рекомендуем практиковать от пяти до 10 мозгов ежедневно в течение нескольких недель, прежде чем собирать мозг для анализа. После обезболивания мухи на углекислотной подушке. Отсортируйте молодых самцов F1 в течение шести часов после эклозии и поместите их в чистые флаконы, содержащие пищу с 40 или менее мухами на флакон.
Если планируется маркировка делящихся клеток с помощью EdU, приготовьте 200 микролитров 50 млн или более EdU в 10% сахарозе и поместите приготовленный раствор на 23-миллиметровую фильтровальную бумагу круглого сорта три в пустой флакон, затем поместите самцов мух во флакон для предварительного кормления за шесть часов до травмы. Затем продезинфицируйте Minutien Pins, поместив примерно 100 штифтов в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, заполненную 70% этанолом в течение пяти минут. Затем продезинфицируйте прокладку из углекислого газа и кисть, распыляя 70% этанола и вытирая насухо чистой безворсовой тканью.
Как только инструменты будут чистыми и сухими, перенесите 40 или менее отсортированных самцов F1 на чистую площадку и разделите их на две группы. Одна группа будет служить в качестве контроля неповрежденных мух. А вторая экспериментальная группа подвергнется проникающей черепно-мозговой травме.
Затем с помощью щипцов вытащите четыре-пять новых штифтов Minutien из трубки микроцентрифуги и поместите их к краю прокладки углекислого газа. Затем под рассекающим прицелом выбирают прямую булавку Minutien с острым острием. Повторно используйте острые штифты и поместите поврежденные или тупые штифты в отдельную трубку, содержащую 70% этанола для безопасной утилизации.
Далее, для мух со стандартным перекрестным переключателем генотипа на стереомикроскопе светодиодная лампа оснащена соответствующими фильтрами возбуждения и излучения для белка зеленой флуоресценции, который допускает возбуждение при 440-460 нанометрах и позволяет визуализировать на 500-560 нанометрах. Затем выберите муху экспериментальной группы и расположите муху так, чтобы экспериментатор имел дорсальный вид головной капсулы с головой мухи головой справа. С помощью щипцов подберите и удерживайте выбранную булавку Minutien в одной руке, а кисть в другой руке.
Затем поместите кисть на переднюю часть спинной грудной клетки и осторожно надавите вниз, чтобы стабилизировать муху. Направьте кончик булавки Minutien на тела грибов клеточные тела с правой стороны головы и проникните в головную капсулу. При использовании ориентиров нацелена на кутикулу спинной головки между оцеллиями и дорсальным краем глаза.
После завершения травмы используйте кисть, чтобы осторожно оттолкнуть голову от булавки Minutien. При использовании мозга для секвенирования РНК или QRT ПЦР нам делают вторую травму на левой стороне головы. После того, как все экспериментальные мухи получили травмы, поместите контрольные и поврежденные мухи в отдельные маркированные флаконы, содержащие пищу.
Уложите флаконы горизонтально, чтобы мухи не попали в пищу. Поместите стандартные поперечные мухи при 25 градусах Цельсия, а окунь летает при 30 градусах Цельсия до возраста. При старении дольше 24 часов переводите мух на чистую пищу каждые один-два дня.
Значительное увеличение пролиферации наблюдалось через 24 часа после травмы с использованием анти-рН3-маркера для клеток, активно подвергающихся митозу. Приблизительно три pH3-положительные клетки наблюдаются в каждом из контрольных центральных мозгов. И 11 pH3 положительных клеток в каждом из поврежденных центральных мозгов.
К семи дням в каждой из контрольных клеток присутствует в среднем две EdU-положительные клетки мозга. И 11 EdU положительных клеток в каждом из поврежденных центральных мозгов, что аналогично результатам, полученным через 24 часа после травмы с антителом pH3. Через 14 дней контрольная группа в среднем имела одну положительную клетку EdU на центральный мозг, а поврежденный мозг в среднем 29 положительных клеток EdU на центральный мозг.
Демонстрация того, что пролиферация клеток продолжается, по крайней мере, на второй неделе после проникающей черепно-мозговой травмы. Самый сильный пролиферативный ответ в центральном мозге наблюдается, когда мозг повреждается в течение первых 24 часов после эклозии. К семи дням после эклозии проникающая травма все еще вызывает значительное увеличение пролиферации.
Однако к 14 дням способность клеток делиться значительно снижается до одной делящейся клетки на мозг. Что похоже на контроль мозга. Используя систему маркировки permatwin, больше клонов permatwin было обнаружено в поврежденных образцах через два дня, за две недели, по сравнению с контрольной группой.
При этом количество клонов увеличивается с течением времени после травмы. Через две недели после травмы в 50% поврежденных мозгов появились новые нейроны грибного тела. Эти новые нейроны проецировали свои дендриты примерно на чашечку тела гриба, а аксоны на доли тела гриба.
Другие области мозга, которые, по-видимому, регенерируют, включают эллипсоидное тело Антеннальные доли и боковой рог. Обязательно используйте острый штифт Minutien при нанесении черепно-мозговых травм, так как использование тупого или изогнутого штифта увеличит смертность. Также не давите слишком сильно на мух кистью, так как это также увеличит смертность.
После этой процедуры иммуногистохимия может быть использована для количественной оценки самораспространения, а также для идентификации новых нейронов и глии.
