Мы разработали метод реактивации покоящихся нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы. Этот метод может поставлять экзогенные факторы в питательные среды и может анализировать реактивацию нейробластов. Лучшая терапия стволовыми клетками может быть разработана путем лучшего понимания того, как покоящиеся стволовые клетки реагируют на внешние сигналы и входят в клеточный цикл.
Продемонстрировать процедуру будет Сьюзан Дойл, научный сотрудник из моей лаборатории. Для начала тщательно соберите примерно от 20 до 25 свежевылупившихся личинок из пластины виноградного агара под рассекающим микроскопом. Наполните чашку Петри примерно двумя миллилитрами PBS и погрузите наконечник инструмента, содержащий личинки, в PBS на две минуты.
Через две минуты опрокиньте чашку под углом, чтобы распустить жидкость на дне, и, используя небольшую кисть, вычистите личинки из жидкости вверх по дну чашки Петри. Соберите все личинки на кисти и ненадолго промойте личинок в 70% этаноле, прежде чем перенести их обратно в чашку Петри, содержащую PBS. Распылите рабочую зону, инструменты для рассечения, щипцы и две стеклянные посуды для часов с 70% этанолом и дайте им высохнуть на скамейке.
Сделайте добавленную питательную среду Шнайдера, или SSM, и поместите ее на лед. Пипетка по одному миллилитру среды в каждую стеклянную посуду для часов. Используя микропипетку со стерильным наконечником, перенесите свежевылупившихся личинок с пластины PBS в SSM в первой стеклянной посуде для часов.
Рассекните мозг из личинок, помещенных во вторую стеклянную часовую тарелку с помощью SSM, используя щипцы под рассекающим микроскопом и регулируя увеличение по мере необходимости. Используйте один щипц, чтобы схватить рот крючками, а с другим осторожно схватите тело на полпути вниз и потяните в противоположном направлении, чтобы расколоть личинку на две части. После рассечения от 15 до 20 мозгов добавьте один миллилитр SSM в один колодец стерильного 24-луночного культурального лотка.
Используя микропипетку и стерильный наконечник, перенесите свежерассеченный мозг в SSM с последующим инкубацией среды с мозгом в течение 24 часов при 25 градусах Цельсия. Пипетка 10 микролитров 10-миллимолярного запаса 5-этинил-2'дезоксиуридина, или EDU, с 990 микролитрами SSM в стерильную микроцентрифужную трубку, перемешайте, затем пипетку одного миллилитра EDU SSM в один лунку стерильного 12-луночного культурального лотка. Перенесите мозги с помощью микропипетки со стерильным наконечником из скважины, содержащей SSM, в новую скважину, содержащую раствор EDU SSM, и инкубируйте в течение одного часа при 25 градусах Цельсия.
Затем перенесите мозги, помеченные EDU, в другой колодец в том же лотке для культур, содержащем один миллилитр фиксатора, и дайте мозгу зафиксироваться в течение 20 минут. После фиксации быстро переведите мозги в 72-луночную мини-лотковую лунку с помощью микропипетки. Промыть мозг три раза в 10 микролитрах ПБТ и повторить три промывания в течение 10 минут каждое, гарантируя, что мозг всегда будет покрыт жидкостью.
Пипетка 10 микролитров блокирующего раствора на мозг. Накройте лоток и запечатайте его полоской парапленки по краю. На рисунке показаны крупногабаритные EDU-положительные и мертво-положительные нейробластные клетки после 24 часов культивирования в SSM с инсулином и окрашиванием.
После 24 часов в дополненной среде Шнайдера без инсулина, только что вылупившийся мозг дикого типа Oregon R не имел больших размеров EDU-положительных и мертвых положительных нейробластных клеток, кроме клеток нейробластов с четырьмя грибами и одной вентролатеральной нейробластной клетки. Во время конфокальной визуализации иногда наблюдались некоторые полушария мозга с повреждением, такие как отверстия от малого до большого размера в эксплантированной мозговой ткани. Любые мозги с отверстиями не использовались для анализа.
Тщательно рассекайте ткани и аккуратно пипетку, чтобы избежать повреждения тканей. Также старайтесь быть как можно более стерильными и не загрязнять свои культуры. Поскольку питательными средами можно легко манипулировать, добавляя различные факторы, этот метод может быть использован для рассмотрения будущих гипотез относительно внешней сигнализации и входа и выхода из нейробластного покоя.
