Так производные нейрминовой кислоты присутствуют только в болезнетворных бактериях, аминигликозилированные жгутики содержат этот сахар. В кадре делеция области, содержащейся в генах, может помочь найти жгутиковые кластеры гликозилирования. Этот метод, новейшие специфические области или гены, такие как гликозилтрансферазы, которые имеют высокую гомологию между ними и участвуют в различных процессах, и анализируют его участие в процессе гликозилирования жгутиков.
Этот метод также может помочь найти роль гликозилтрансфераз, участвующих в биосинтезе соответствующих полисахаридов в патогенных бактериях, а также роль генов, кодирующих белки, участвующие в образовании жгутиков. Продемонстрировать процедуру будет Майте Поло, техник моей лаборатории. Разработайте две пары праймеров, которые амплируют области ДНК вверх и вниз по течению от выбранного гена или области, подлежащей удалению.
Грунтовки A и D должны включать на пяти основных концах участок ограничения для эндонуклеазы, который позволяет клонировать в pDM4. Убедитесь, что праймеры B и C находятся внутри гена, подлежащего удалению, или внутри первого и последнего гена области, подлежащей удалению. Убедитесь, что оба праймера находятся в рамке и расположены между пятью и шестью кодонами внутри гена.
Убедитесь, что оба праймера включают в себя 21 пару оснований комплиментарной последовательности на пяти основных концах для соединения ампликонов ДНК AB и CD.Используйте 100 нанограммов очищенной хромосомной ДНК в качестве шаблона в двух наборах асимметричных ПЦР с праймерами AB и CD с последующим анализом результирующих продуктов в 1% агарозном геле. Очистите и количественно оцените иссеченные ампликоны из электрофоретического геля. Смешайте 100 нанограмм каждого ампликона с реагентами ПЦР без праймера.
После его расширения добавьте буквари A и D и усилите их как один фрагмент. Затем проанализируйте, очистите и количественно оцените полученные продукты, как описано ранее. Переваривают один микрограмм pDM4 и 400 нанограммов ампликона AD с эндонуклеазой.
Соедините переваренный pDM4 с ампликоном AD на молярном векторе, чтобы вставить соотношение один к четырем и подготовить реакцию лигирования. Инкубировать на ночь при температуре 20 градусов по Цельсию. Позже инактивируют Т4-лигазу при 70 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Привить штамм Escherichia coli в бульон Luria Bertani Miller и инкубировать при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока не будет наблюдаться оптическая плотность от 0,4 до 0,6. Гранулируйте бактерии методом центрифугирования при 5000 г и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Суспендировать гранулу в охлажденной дистиллированной воде и повторить процесс очистки еще два раза.
Перенесите суспензию бактерий в микрофьюжные трубки и повторите центрифугирование при 14 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После повторного использования гранулы в охлажденной воде добавьте примерно 3,5 микролитра лиг лигационной смеси и инкубируйте на льду в течение пяти минут. Перенесите содержимое в охлажденную двухмиллиметровую электропорационную кювету.
После электропорации добавляют среду SOC и переносят содержимое в культуральную трубку. Инкубировать в течение одного часа при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. Нанесите трансформированные клетки на пластины агара LB, дополненные хлорамфениколом.
Проверьте вставку конструкции удаления в pDM4 с помощью ПЦР с помощью праймеров, которые обрамляют сторону клонирования pDM4. Подготовьте ночные культуры таким образом, чтобы реципиент Aeromonas резистентный штамм рифампицина и два разных штамма кишечной палочки. Донорский штамм с рекомбинантной плазмидой pDM4 и вспомогательный штамм с плазмидой PRK 2073 при 30 градусах Цельсия.
Приостановите одинаковое количество колоний донора, реципиента и вспомогательного штаммов в трех трубках LB со 150 микролитрами LB. Затем на агаровой пластине LB без антибиотиков смешайте три бактериальные суспензии в двух каплях у реципиента, чтобы помочь донору соотношение пять к одному к одному, и инкубируйте пластину лицевой стороной вверх на ночь при 30 градусах Цельсия. Соберите бактерии, добавив один миллилитр бульона LB в агаровую пластину LB. Перенесите бактериальную суспензию в коническую 1,5-миллилитровую микрофьюжную трубку и энергично вихрево.
Нанесите 100 микролитров бактериальной суспензии на пластины агара LB с рифампицином и хлорамфениколом. Открутите 200 микролитров и 600 микролитров образцов, суспендируйте гранулу в 100 микролитрах бульона LB и пластину на агаре LB с рифампицином и хлорамфениколом с последующей инкубацией. Проведите тест на оксидазу, чтобы подтвердить, что колонии являются aeromonas.
Далее подтверждают введение рекомбинантной плазмиды pDM4 в специфическую хромосомную область методом ПЦР с использованием праймеров E и F. Вырастите рекомбинантные колонии в двух миллилитрах LB с 10% сахарозой и без антибиотиков в течение ночи при 30 градусах Цельсия. После приготовления различных культуральных разведений, пластину 100 микролитров бактериальных культур и разведения на пластине агара LB с 10% сахарозой и инкубируют в течение ночи при 30 градусах Цельсия.
На следующий день заберите колонии и переложите их на пластины LB с хлорамфениколом и без него. После инкубации их в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия выберите чувствительные к хлорамфениколу колонии. Проанализируйте чувствительные колонии методом ПЦР с помощью пары праймеров EF и выберите колонии, продукт ПЦР которых коррелировал с размером удаленной конструкции.
Положите небольшую каплю силикона в четыре угла крышки слайда и установите на ночь выращенную культуру Aeromonas на горку крышки. Поместите выкопанную горку на горку крышки и переверните горку вверх дном. Проанализируйте подвижность плавания с помощью световой микроскопии с помощью оптического микроскопа, затем перенесите три микролитра культуры на центр мягкой агаровой пластины.
Инкубируйте пластину лицевой стороной вверх в течение ночи от 25 до 30 градусов по Цельсию. Используя линейку в конце инкубации, измерьте бактериальную миграцию от центра пластины к периферии через агар. Культуру Aeromonas процеживают в течение ночи в 900 миллилитров TSB от 25 до 30 градусов Цельсия.
После центрифугирования суспендировать гранулу в 20 миллилитрах 100 миллимолярного трисхлоридно-водородного буфера рН 7,8. Чтобы удалить закрепленные жгутики, очистите подвеску в вихре со стеклянным стержнем в течение трех-четырех минут, а затем пройдите повторно через шприц 21 калибра. Гранулируйте бактерии двумя последовательными центрифугациями при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант в отдельную трубку.
После ультрацентрифугирования супернатанта суспендировать гранулу в 150 микролитрах 100 миллимоляров трис хлористого водорода, содержащего два миллимолярных буфера ЭДТА. Переложите 150 микролитров обогащенной фракции жгутиков в тонкостенную сверхпрозрачную трубку и заполните ее 12 миллилитрами раствора хлорида цезия. Ультрацентрифугирование трубы при 60 000 G в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ковша.
Соберите жгутиковую полосу в градиент хлорида цезия с помощью шприца и диализуйте против 100 миллимоляров трисхлорида водорода плюс два миллимоляра ЭДТА с последующим анализом электрофореза и синим окрашиванием Кумасси или масс-спектрометрией. На следующем рисунке полоса WT - Aeromonas piscicola AH3. Полосы от одной до восьми показывают чувствительные к хлорамфениколу колонии второй рекомбинации.
ST является гиперпузырным 1KB маркером. Полосы от одной до трех и от пяти до восьми показывают колонии с диким геном FGI4 как полосу WT. Четвертая полоса показывает колонию с удаленным геном FGI4. Анализы световой микроскопии показали, что полярные или боковые модификации жгутиков приводят только к уменьшению диаметров миграции, таким образом, мутанты AH-3 FGI и мутанты AH-3 FGI-4 показывают только снижение подвижности по отношению к штамму дикого типа.
На рисунке показан полярный жгутик из AH-3 первой полосы, а также отсутствие мутантов в области FGI второй полосы и гена FGI-4 третьей полосы, где оба мутанта имеют полярные жгутики с более низкой молекулярной массой, чем штамм дикого типа, что предполагает изменения в гликана жгутиков. Важно следить за тем, чтобы мутации не влияли на нисходящие гены и приводили к неспособности к сборке жгутиков или неспособности нитей жгутиков. Когда изменения в белках флагеллина не обнаруживаются, требуется масс-спектрометрический анализ с использованием общего белка пептидов жгутика, чтобы узнать массу гликана.
