Quindi i derivati dell'acido neurminico sono presenti solo nei batteri patogeni, i flagelli aminiglycosilati contengono questo zucchero. Nella delezione della regione contenuta nei geni può aiutare a trovare i cluster di glicosilazione dei flagelli. Questa tecnica, l'ultima regione specifica o geni, come le glicosiltransferasi che hanno un'alta omologia tra loro e sono coinvolti in diversi processi, e analizza il suo coinvolgimento nel processo di glicosilazione dei flagelli.
Questa tecnica può anche aiutare a trovare il ruolo delle glicosiltransferasi coinvolte nella biosintesi dei polisaccaridi rilevanti nei batteri patogeni e anche il ruolo delle proteine che codificano i geni coinvolte nella formazione dei flagelli. A dimostrare la procedura sarà Maite Polo, un tecnico del mio laboratorio. Progettare due coppie di primer che amplifichino le regioni del DNA a monte e a valle del gene o della regione selezionata da eliminare.
I primer A e D devono includere all'estremità primaria cinque, un sito di restrizione per un'endonucleasi che consenta la clonazione in pDM4. Assicurarsi che i primer B e C siano all'interno del gene da eliminare o all'interno del primo e dell'ultimo gene della regione da eliminare. Assicurarsi che entrambi i primer siano nel frame e situati tra cinque e sei codoni all'interno del gene.
Assicurarsi che entrambi i primer includano una sequenza complementare di 21 coppie di basi alle cinque estremità prime per unire gli ampliconi del DNA AB e CD.Utilizzare 100 nanogrammi di DNA cromosomico purificato come modello in due serie di PCR asimmetriche con primer AB e CD seguite dall'analisi dei prodotti risultanti in gel di agarosio all'1%. Purificare e quantificare gli ampliconi asportati dal gel elettroforetico. Mescolare 100 nanogrammi di ciascun amplicon con reagenti PCR senza primer.
Dopo averlo esteso, aggiungi primer A e D e amplificali come un singolo frammento. Successivamente analizzare, purificare e quantificare i prodotti risultanti come precedentemente descritto. Digerire un microgrammo di pDM4 e 400 nanogrammi di AD amplicon con un'endonucleasi.
Combinare il pDM4 digerito con l'amplicon AD in un vettore molare per inserire un rapporto da uno a quattro e preparare la reazione di legatura. Incubare durante la notte a 20 gradi Celsius. Successivamente, inattivare T4 ligasi a 70 gradi Celsius per 20 minuti.
Inoculare il ceppo di Escherichia coli nel brodo di Luria Bertani Miller e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM fino a quando non si osserva una densità ottica compresa tra 0,4 e 0,6. Pellet la coltura batterica mediante centrifugazione a 5.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Sospendere il pellet in acqua distillata refrigerata e ripetere il processo di pulizia altre due volte.
Trasferire la sospensione batterica in tubi di microfuga e ripetere la centrifugazione a 14.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver risospeso il pellet in acqua refrigerata, aggiungere circa 3,5 microlitri della miscela di legatura e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Trasferire il contenuto in una cuvetta elettroporatoria refrigerata a due millimetri.
Dopo l'elettroporazione aggiungere il mezzo SOC e trasferire il contenuto in un tubo di coltura. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM. Placcare le cellule trasformate su piastre di agar LB integrate con cloramfenicolo.
Controllare l'inserimento del costrutto di eliminazione in pDM4 mediante PCR utilizzando primer che fiancheggiano il lato di clonazione pDM4. Preparare colture notturne in modo che il destinatario Aeromonas proponga resistente alla rifampicina e due diversi ceppi di Escherichia coli. Il ceppo donatore con il plasmide ricombinante pDM4 e il ceppo helper con il plasmide PRK 2073 a 30 gradi Celsius.
Sospendere lo stesso numero di colonie dei ceppi donatore, ricevente e aiutante in tre tubi LB con 150 microlitri di LB. Quindi su una piastra di agar LB senza antibiotici mescolare le tre sospensioni batteriche in due gocce in un ricevente per aiutare il rapporto donatore di cinque a uno a uno, e incubare la piastra rivolta verso l'alto durante la notte a 30 gradi Celsius. Raccogli i batteri aggiungendo un millilitro di brodo LB alla piastra di agar LB. Trasferire la sospensione batterica in un tubo conico da 1,5 millilitri per microfughe e vortici vigorosamente.
Distribuire 100 microlitri della sospensione batterica su piastre di agar LB con rifampicina e cloramfenicolo. Spin down 200 microlitri e 600 microlitri dei campioni, sospendere il pellet in 100 microlitri di brodo LB e piastra su LB agar con rifampicina e cloramfenicolo seguita da incubazione. Eseguire un test ossidasi per confermare che le colonie sono Aeromonas.
Confermare ulteriormente l'inserimento del plasmide ricombinante pDM4 nella regione cromosomica specifica mediante PCR utilizzando i primer E e F. Coltiva le colonie ricombinanti in due millilitri di LB con il 10% di saccarosio e senza antibiotici durante la notte a 30 gradi Celsius. Dopo aver preparato diverse diluizioni di coltura, piastra 100 microlitri delle colture batteriche e diluizioni su piastra lb agar con 10% di saccarosio e incubare durante la notte a 30 gradi Celsius.
Il giorno dopo, raccogliere le colonie e trasferirle in piastre LB con e senza cloramfenicolo. Dopo averli incubati durante la notte a 30 gradi Celsius, selezionare le colonie sensibili al cloramfenicolo. Analizzare le colonie sensibili mediante PCR utilizzando la coppia di primer EF e selezionare le colonie il cui prodotto PCR è correlato alla dimensione del costrutto eliminato.
Metti una piccola goccia di silicone nei quattro angoli della diapositiva di copertura e monta la cultura coltivata durante la notte di Aeromonas su una diapositiva di copertura. Posizionare una diapositiva scavata sulla diapositiva di copertura e capovolgere la diapositiva. Analizzare la motilità del nuoto al microscopio ottico utilizzando un microscopio ottico, quindi trasferire tre microlitri della coltura sul centro di una piastra di agar morbida.
Incubare la piastra rivolta verso l'alto durante la notte tra 25 e 30 gradi Celsius. Usando un righello alla fine dell'incubazione, misurare la migrazione batterica dal centro della piastra verso la periferia attraverso l'agar. Cultura Aeromonas ceppi durante la notte in 900 millilitri TSB tra 25 e 30 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet in 20 millilitri di tampone trizolare di acido cloridrico da 100 millimolari di pH 7,8. Per rimuovere i flagelli ancorati, versare la sospensione in un vortice con una barra di vetro per tre o quattro minuti, quindi passare ripetutamente attraverso una siringa calibro 21. Pellet i batteri con due centrifugazioni consecutive a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in un tubo separato.
Dopo aver ultracentrifugato il surnatante, sospendere il pellet in 150 microlitri di 100 millimolari tris acido cloridrico contenenti due tamponi EDTA millimolari. Trasferire 150 microlitri della frazione arricchita di flagelli in un tubo ultra chiaro a pareti sottili e riempirlo con 12 millilitri di soluzione di cloruro di cesio. Ultracentrifugare il tubo a 60.000 volte G per 48 ore a quattro gradi Celsius in un rotore a benna oscillante.
Raccogliere la banda del flagello nel gradiente del cloruro di cesio con una siringa e dializzare contro 100 millimolari di cloruro di idrogeno Tris più due EDTA millimolari seguiti da analisi mediante elettroforesi e colorazione blu di Coomassie o spettrometria di massa. Nella figura seguente, la corsia WT è Aeromonas piscicola AH3. Le corsie da uno a otto mostrano colonie sensibili al cloramfenicolo della seconda ricombinazione.
ST è un marcatore iper vescicale da 1 KB. Le corsie da uno a tre e da cinque a otto mostrano le colonie con gene FGI4 di tipo selvaggio come lane WT. La corsia quattro mostra una colonia con il gene FGI4 cancellato. I saggi al microscopio ottico hanno mostrato che le modifiche dei flagelli polari o laterali portano solo a riduzioni dei diametri di migrazione, quindi i mutanti AH-3 FGI e AH-3 FGI-4 mostrano solo una ridotta motilità in relazione al ceppo wild type.
La figura mostra il flagello polare da AH-3 della corsia uno, e i non mutanti nella regione FGI della corsia due e il gene FGI-4 della corsia tre, in cui entrambi i mutanti hanno flagelline polari con peso molecolare inferiore rispetto al ceppo wild type, il che suggerisce alterazioni nel glicano flagello. È importante assicurarsi che le mutazioni non influenzino i geni a valle e portino all'incapacità all'assemblaggio dei flagelli o all'incapacità dei filamenti di flagelli. Quando il cambiamento nelle proteine della flagellina non è rilevabile, è necessaria l'analisi della spettrometria di massa utilizzando la proteina totale dei peptidi flagellina per conoscere la massa glicanica.
