そこでニュールミン酸誘導体は病原性細菌にのみ存在し、アミニグリコシル化鞭毛はこの糖を含んでいる。遺伝子に含まれる領域のインフレーム欠失は、鞭毛グリコシル化クラスターを見つけるのを助けることができる。この技術は、それらの間で高い相同性を有する糖転移酵素などの最新の特定の領域または遺伝子が異なるプロセスに関与しており、鞭毛糖鎖付加プロセスへのその関与を解析するものである。
この技術は、病原性細菌における関連する多糖類の生合成に関与する糖転移酵素の役割、および鞭毛形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の役割を見出すのにも役立つ可能性がある。手順を実演すると、私の研究室の技術者であるマイテポロになります。選択した遺伝子または欠失する領域の上流および下流のDNA領域を増幅する2対のプライマーを設計する。
プライマーAおよびDは、5つのプライム末端に、pDM4におけるクローニングを可能にするエンドヌクレアーゼの制限部位を含む必要がある。プライマーBおよびCが、欠失する遺伝子内または欠失する領域の最初と最後の遺伝子の内側にあることを確認します。両方のプライマーがフレーム内にあり、遺伝子内の5〜6つのコドンの間に配置されていることを確認します。
両方のプライマーが 5 つのプライム末端に 21 塩基対の相補配列を含むことを確認し、DNA アンプリコン AB および CD.AB プライマーと CD プライマーを使用した 2 組の不斉 PCR で 100 ナノグラムの精製染色体 DNA を鋳型として使用し、その後、得られた生成物を 1%アガロースゲルで分析します。電気泳動ゲルから切り出したアンプリコンを精製および定量する。各アンプリコン100ナノグラムをプライマーなしでPCR試薬と混合する。
それを拡張した後、AプライマーとDプライマーを加え、それらを単一の断片として増幅する。次に、前述のように、得られた生成物を分析、精製、定量化します。1マイクログラムのpDM4および400ナノグラムのADアンプリコンをエンドヌクレアーゼで消化する。
消化したpDM4とADアンプリコンをモルベクターで結合させ、挿入比を1対4にし、ライゲーション反応を調製する。摂氏20度で一晩インキュベートする。その後、T4リガーゼを摂氏70度で20分間不活性化する。
エシェリヒア・コリ株をルリア・ベルタニ・ミラー培養液に接種し、0.4~0.6の光学密度が観察されるまで200RPMで振とうしながら摂氏30度でインキュベートします。ペレットは、細菌培養物を5,000倍Gおよび4°Cで15分間遠心分離することによって行う。ペレットをチルド蒸留水に懸濁し、洗浄工程をさらに2回繰り返す。
細菌懸濁液をマイクロフュージチューブに移し、14, 000回Gおよび4°Cで5分間遠心分離を繰り返す。ペレットを冷水に再懸濁した後、約3.5マイクロリットルのライゲーション混合物を加え、氷上で5分間インキュベートする。内容物を冷やした2ミリメートルギャップエレクトロポレーションキュベットに移す。
エレクトロポレーション後、SOC培地を加え、内容物を培養管に移す。摂氏30度で1時間インキュベートし、200RPMで振とうする。形質転換細胞をクロラムフェニコールを添加したLB寒天プレート上にプレートする。
pDM4クローニング側に隣接するプライマーを用いたPCRによりpDM4への欠失構築物の挿入を確認する。レシピエントアエロモナス株がリファンピシン耐性となるように一晩培養物を準備し、大腸菌の2つの異なる株を準備する。ドナー株をpDM4組換えプラスミドで、ヘルパー株をPRK 2073プラスミドを摂氏30度で得た。
ドナー、レシピエント、およびヘルパー株の同数のコロニーを、150マイクロリットルのLBを有する3つのLBチューブに懸濁させる。次いで、抗生物質を含まないLB寒天プレート上で、3つの細菌懸濁液を2滴に混合し、レシピエント対ヘルパー対ドナー比が5対1対1で、プレートを摂氏30度で一晩上を向いてインキュベートした。LB寒天プレートに1ミリリットルのLBブロスを加えて細菌を採取する。細菌懸濁液を円錐形の1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、激しく渦巻きます。
リファンピシンおよびクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上に100マイクロリットルの細菌懸濁液を広げる。200マイクロリットルおよび600マイクロリットルのサンプルをスピンダウンし、ペレットを100マイクロリットルのLBブロスに懸濁し、リファンピシンおよびクロラムフェニコールを含むLB寒天上にプレートし、続いてインキュベーションした。オキシダーゼ試験を行い、コロニーがアエロモナスであることを確認する。
さらにEプライマー及びFプライマーを用いたPCRにより特異的染色体領域へのpDM4組換えプラスミドの挿入を確認する。組換えコロニーを2ミリリットルのLBで10%スクロースで抗生物質なしで摂氏30度で一晩成長させる。異なる培養希釈液を調製した後、100マイクロリットルの細菌培養物および希釈物を10%スクロースでLB寒天プレート上にプレートし、摂氏30度で一晩インキュベートした。
翌日、コロニーを拾い上げ、クロラムフェニコールの有無にかかわらずLBプレートに移す。それらを摂氏30度で一晩インキュベートした後、クロラムフェニコール感受性コロニーを選択する。EFプライマーペアを用いたPCRにより感受性コロニーを分析し、PCR産物が欠失した構築物のサイズと相関するコロニーを選択する。
カバースライドの四隅にシリコーンの小さな滴を入れ、カバースライドに一晩成長したアエロモナスの培養物をマウントします。カバースライドの上に掘削スライドを置き、スライドを裏返します。光学顕微鏡を用いた光学顕微鏡により遊泳運動性を分析し、次いで培養物3マイクロリットルを軟寒天プレートの中心に移す。
プレートを摂氏25〜30度の間で一晩上向きにインキュベートします。インキュベーションの最後に定規を用いて、プレート中心から寒天を通る周辺への細菌移動を測定する。培養アエロモナスは、摂氏25〜30度の間の900ミリリットルTSBで一晩株を培養する。
遠心分離後、ペレットを20ミリリットルの100ミリモルのトリス塩化水素緩衝液にpH7.8の懸濁させる。固定された鞭毛を除去するには、ガラスバーで渦の中で懸濁液を3〜4分間透けてから、21ゲージシリンジに繰り返し通します。摂氏4度で2回連続遠心分離により細菌をペレット化し、上清を別のチューブに集めた。
上清を超遠心分離した後、ペレットを150マイクロリットルの100ミリモルのトリス塩化水素2ミリモルEDTA緩衝液を含む緩衝液に懸濁する。鞭毛の濃縮画分の150マイクロリットルを薄壁の超透明チューブに移し、12ミリリットルの塩化セシウム溶液で満たす。チューブを60,000倍Gで超遠心分離機で、スイングバケットローターで摂氏4度で48時間処理します。
鞭毛バンドをシリンジで塩化セシウム勾配に集め、100ミリモルの塩化トリス水素と2ミリモルのEDTAを比べて透析し、電気泳動とクーマシーブルー染色または質量分析による分析を行った。次の図では、レーンWTはアエロモナス・ピシコーラAH3です。レーン1〜8は、第2の組換えのクロラムフェニコール感受性コロニーを示す。
STは1KBマーカーのハイパーブラダーである。レーン1~3及び5~8は、野生型FGI4遺伝子を有するコロニーをレーンWTとして示す。レーン4は、欠失したFGI4遺伝子を有するコロニーを示す。光学顕微鏡アッセイは、極性または側方鞭毛修飾が遊走直径の減少のみをもたらすことを示し、したがって、AH−3 FGI変異体およびAH−3 FGI−4変異体は、野生型株に関連して減少した運動性のみを示す。
図はレーン1のAH-3由来の極性鞭毛を示しており、レーン2のFGI領域に変異体がなく、レーン3のFGI-4遺伝子では、両変異体は野生株よりも分子量の低い極性鞭毛を有しており、鞭毛糖の変化を示唆している。突然変異が下流の遺伝子に影響を与えず、鞭毛アセンブリ不能または鞭毛のフィラメントの不能を招かないようにすることが重要です。フラジェリンタンパク質の変化が検出できない場合、グリカン質量を知るためにフラジェリンペプチドの全タンパク質を用いた質量分析が必要である。
