그래서 신경산 유도체는 병원성 박테리아에만 존재하며, aminiglycosylated flagella는이 설탕을 함유하고 있습니다. 프레임에서 유전자에 포함된 영역의 결실은 편모 글리코실화 클러스터를 찾는 것을 도울 수 있다. 이러한 기술은, 그들 사이에 높은 상동성을 가지며 상이한 과정에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제와 같은 최신 특정 영역 또는 유전자, 및 편모 글리코실화 과정에 대한 그의 관여를 분석한다.
이 기술은 또한 병원성 박테리아에서 관련 다당류의 생합성에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제의 역할과 편모 형성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 역할을 찾는 데 도움이 될 수 있다. 절차를 시연하면 내 실험실의 기술자 인 Maite Polo가 될 것입니다. 결실될 선택된 유전자 또는 영역의 상류 및 하류의 DNA 영역을 증폭시키는 두 쌍의 프라이머를 설계한다.
프라이머 A 및 D는 pDM4에서의 클로닝을 허용하는 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위인 다섯 개의 프라임 말단에 포함할 필요가 있다. 프라이머 B 및 C가 결실될 유전자 내에 있거나 결실될 영역의 첫 번째 및 마지막 유전자 내에 있는지 확인하십시오. 두 프라이머가 프레임 내에 있고 유전자 내부에 다섯 개에서 여섯 개의 코돈 사이에 위치하는지 확인하십시오.
두 프라이머 모두 DNA 앰플리콘 AB 및 CD에 결합하기 위해 다섯 개의 프라임 말단에 21개의 염기쌍 무료 서열을 포함하는지 확인하십시오.정제된 염색체 DNA 100나노그램을 AB 및 CD 프라이머가 있는 비대칭 PCR 두 세트에서 주형으로 사용한 다음 1%아가로스 겔에서 결과물을 분석합니다. 전기영동 겔로부터 적출된 앰플리콘을 정제하고 정량화한다. 각 앰플리콘 100나노그램을 프라이머 없이 PCR 시약과 섞는다.
그것을 확장 한 후, A 및 D 프라이머를 추가하고 단일 단편으로 증폭하십시오. 다음으로 앞서 설명한 바와 같이 결과 제품을 분석, 정제 및 정량화합니다. pDM4 한 마이크로 그램과 400 나노그램의 AD 앰플리콘을 엔도뉴클레아제로 소화하십시오.
소화된 pDM4를 몰 벡터에서 AD 앰플리콘과 결합하여 하나 내지 4의 비율로 삽입하고 라이게이션 반응을 준비한다. 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 나중에 섭씨 70도에서 20 분 동안 T4 리가아제를 비활성화하십시오.
에스케리치아 콜리 균주를 루리아 베르타니 밀러 브로스에 접종하고 0.4와 0.6 사이의 광학 밀도가 관찰될 때까지 200RPM에서 진탕하면서 섭씨 30도에서 배양한다. 균 배양물을 섭씨 5, 000배 및 사섭씨 5도에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 펠렛을 차가운 증류수에 현탁시키고 세척 과정을 두 번 더 반복하십시오.
박테리아 현탁액을 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 섭씨 14, 000배 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리를 반복한다. 펠렛을 냉각수에 재현탁시킨 후, 약 3.5 마이크로리터의 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 내용물을 냉각된 두 밀리미터 간격 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.
전기천공 후 SOC 배지를 첨가하고 내용물을 배양 튜브로 옮긴다. 섭씨 30도에서 한 시간 동안 인큐베이션하고 200RPM에서 진탕한다. 형질전환된 세포를 클로람페니콜로 보충된 LB 한천 플레이트 상에 플레이트화한다.
pDM4 클로닝 측을 플랭크하는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 pDM4 내로의 결실 작제물의 삽입을 확인한다. 수용자 에어로모나스 균주가 리팜피신 내성 균주와 대장균의 두 가지 다른 균주가 되도록 하룻밤 배양물을 준비한다. 공여체 균주를 pDM4 재조합 플라스미드와 함께, 섭씨 30도에서 PRK 2073 플라스미드를 갖는 헬퍼 균주.
150 마이크로리터의 LB를 가진 세 개의 LB 튜브에 기증자, 수혜자 및 도우미 균주의 동일한 수의 콜로니를 중단시킨다. 그런 다음 항생제가 없는 LB 한천 플레이트 상에서 세 개의 박테리아 현탁액을 수용자에서 두 방울로 섞어 조력자 대 공여체 비율이 다섯 대 일대일 비율인 후, 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 위로 향하게 배양한다. LB 한천 플레이트에 LB 국물 한 밀리리터를 첨가하여 박테리아를 수확합니다. 박테리아 현탁액을 원뿔형 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 격렬하게 소용돌이친다.
100 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 리팜피신과 클로람페니콜로 LB 한천 플레이트에 퍼뜨립니다. 200 마이크로리터 및 600 마이크로리터의 샘플을 스핀다운하고, 펠렛을 100 마이크로리터의 LB 브로스에 현탁시키고, 플레이트를 리팜피신 및 클로람페니콜로 LB 한천 상에 현탁시킨 다음, 인큐베이션하였다. 옥시다제 테스트를 수행하여 콜로니가 에어로모나스인지 확인합니다.
또한 E와 F 프라이머를 이용한 PCR을 통해 pDM4 재조합 플라스미드를 특정 염색체 영역에 삽입한 것을 확인하였다. 재조합 콜로니를 10 % 수크로오스와 항생제없이 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 LB의 두 밀리리터로 성장시킵니다. 상이한 배양 희석물을 준비한 후, 박테리아 배양물 100 마이크로리터 및 희석액을 LB 한천 플레이트 상에 10%sucrose로 플레이트하고 섭씨 30도에서 밤새 인큐베이션한다.
다음날 콜로니를 집어 들고 클로람페니콜 유무에 관계없이 LB 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양한 후, 클로람페니콜 민감성 콜로니를 선택한다. EF 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 민감한 콜로니를 분석하고 PCR 산물이 삭제된 구축물의 크기와 상관관계가 있는 콜로니를 선택한다.
커버 슬라이드의 네 모서리에 작은 실리콘 방울을 넣고 커버 슬라이드에 밤새 자란 Aeromonas 배양물을 장착하십시오. 발굴 된 슬라이드를 커버 슬라이드에 놓고 슬라이드를 거꾸로 돌립니다. 광학 현미경을 사용하여 광 현미경으로 수영 운동성을 분석 한 다음 배양물의 세 마이크로 리터를 부드러운 한천 플레이트의 중앙으로 옮깁니다.
플레이트를 섭씨 25도에서 30도 사이에서 밤새 위로 향하게하십시오. 인큐베이션의 끝에서 통치자를 사용하여, 한천을 통해 플레이트 중심에서 주변부쪽으로 박테리아 이동을 측정한다. 배양 에어로모나스는 섭씨 25도에서 30도 사이의 900 밀리리터 TSB에서 하룻밤 동안 균주를 균주.
원심분리 후, 펠렛을 pH 7.8의 100 밀리몰 트리스 염화수소 완충액의 20 밀리리터에 현탁시킨다. 고정 된 편모를 제거하려면 유리 막대가있는 소용돌이에 서스펜션을 서너 분 동안 깎은 다음 21 게이지 주사기를 통해 반복적으로 통과하십시오. 섭씨 네 도에서 두 번의 연속 원심분리에 의해 박테리아를 펠릿화하고 상청액을 별도의 튜브로 수집한다.
상청액을 초원심분리한 후, 펠렛을 두 밀리몰 EDTA 완충액을 함유하는 100 밀리몰 트리스 염화수소의 150 마이크로리터에 현탁시킨다. 편모의 농축 된 부분 150 마이크로 리터를 얇은 벽으로 둘러싸인 초투명 튜브로 옮기고 12 밀리리터의 염화 세슘 용액으로 채 웁니다. 튜브를 60, 000 배 G에서 48 시간 동안 섭씨 4도에서 스윙 버킷 로터에서 초원심분리합니다.
편모 밴드를 주사기로 염화세슘 구배로 모으고 100 밀리몰 트리스 염화수소와 두 밀리몰 EDTA에 대해 투석한 다음 전기 영동 및 쿠마시 블루 염색 또는 질량 분광법으로 분석합니다. 다음 그림에서, 레인 WT는 에어로모나스 피시콜라 AH3이다. 레인 하나 내지 여덟 개는 클로람페니콜 민감성 콜로니를 두 번째 재조합의 나타낸다.
ST는 하이퍼 방광 1KB 마커입니다. 레인 하나 내지 셋 및 다섯내지 여덟은 레인 WT로서 야생형 FGI4 유전자를 갖는 콜로니를 나타낸다. 레인 4는 결실된 FGI4 유전자를 갖는 콜로니를 나타낸다. 광 현미경 분석은 극성 또는 측방향 편모 변형이 단지 이동 직경의 감소로 이어진다는 것을 보여주었고, 따라서, AH-3 FGI 돌연변이체 및 AH-3 FGI-4 돌연변이체는 야생형 균주와 관련하여 감소된 운동성만을 보여준다.
도면은 레인 1의 AH-3으로부터의 극성 편모를 보여주고, 레인 2의 FGI 영역과 레인 3의 FGI-4 유전자에 돌연변이가 없음을 보여주며, 여기서 두 돌연변이체 모두 야생형 균주보다 낮은 분자량을 갖는 극성 편모를 가지며, 이는 편모 글리칸의 변화를 시사한다. 돌연변이가 하류 유전자에 영향을 미치지 않고 편모 조립에 대한 무능력 또는 편모의 필라멘트의 무능을 유도하는 것이 중요합니다. 편모 단백질의 변화가 검출 가능하지 않을 때, 글리칸 질량을 알기 위해 편모 펩티드의 총 단백질을 사용하여 질량 분광법 분석이 필요합니다.
